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【摘要】  目的觀察金銀花提取物體外抑制甲型流感病毒FM1株的作用。方法 采用血凝試驗方法,測定不同濃度金銀花提取物體外和雞胚內(nèi)抑制流感病毒效價,分析金銀花提取物對病毒增殖的影響。結(jié)果 與病毒對照組比較,金銀花提取物組血凝效價降低,其抑制作用時間可從1 h持續(xù)到24 h,其對病毒的抑制作用隨著藥物濃度的降低而逐漸減弱；金銀花提取物在100、50、25 mg/mL時,對感染流感病毒雞胚具有預(yù)防和保護治療作用(P<0.001),而在100 mg/mL時的預(yù)防作用明顯優(yōu)于陽性對照病毒唑組(P<0.05)。結(jié)論 金銀花提取物可有效抑制甲型流感病毒FM1株。

【關(guān)鍵詞】  甲型流感病毒；金銀花提取物；綠原酸；雞胚

　　本實驗對金銀花體外抗流感病毒作用進行系列研究,旨在闡明該藥在中藥復(fù)方銀翹散中抗流感病毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ),為將該藥及其有關(guān)復(fù)方研制成治療病毒性呼吸道疾病的現(xiàn)代(復(fù)方)中藥奠定基礎(chǔ)。

　　1  實驗材料

　　1.1  藥物及主要試劑

　　金銀花飲片購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診藥局,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥分析教研室張振秋教授鑒定為忍冬科植物忍冬的花蕾金銀花。利巴韋林注射液(江蘇吳中實業(yè)股份有限公司,批號060208)；綠原酸對照品(自配,濃度0.111 2 mg/mL)。

　　1.2  病毒

　　甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/FM1/47(H1N1),中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供,凍存于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)病毒室,經(jīng)鼠肺、雞胚傳代后為FM1M9E2M1E3M2E4M1E5。

　　1.3  雞胚

　　9日齡尼克白種雞胚,SPF級,購于遼寧省益康生物制品廠。

　　1.4  1%雞紅細(xì)胞懸液

　　采集健康公雞血,阿氏液抗凝,生理鹽水1 500 r/min離心洗滌3次,棄上清,以無菌生理鹽水配制成1%懸液,4 ℃冷藏備用[1]。

　　1.5  主要儀器

　�、蚣壣�物安全柜(美國Baker公司,型號：SG403TXCE)；高效液相色譜儀(日本島津SPD-10AVP)；N-2000雙通道色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息工作研究所)；低溫高速離心機(德國Heraeus,型號：Biofuge 28RS)；臺式壓力蒸汽滅菌器(沈陽盛達(dá)生物電子設(shè)備有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)；AS3120電子超聲儀。

　　2  實驗方法

　　2.1  金銀花提取物的制備及其鑒定

　　2.1.1  藥物提取

　　電子天平稱量金銀花飲片放入圓底燒瓶中,加入配制好的80%乙醇14倍量,電熱套加熱回流2 h；第1次提取后傾倒濾液,藥渣再加80%乙醇10倍量,加熱回流1 h；合并濾液,加熱濃縮,水浴箱通風(fēng)櫥加熱揮發(fā)成膏狀,置于電熱烘箱內(nèi)烘干,研成粉末避光冷藏備用。用于體外實驗時,用生理鹽水配成濃度為400 mg/mL的溶液,高速離心機4 000 r/min離心30 min,取上清,高溫高壓滅菌后4 ℃冷藏備用。

　　2.1.2  供試品溶液的制備

　　精稱樣品粉末0.1751 g,置錐形瓶中,加50%甲醇50 mL定容,超聲30 min；放冷,過濾,取續(xù)濾液5 mL,入棕色量瓶保存待測,檢測時用0.45 μm微孔濾膜過濾。

　　2.1.3  標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及樣品的測定

　　吸取對照品溶液5 μL注入液相色譜儀,以乙腈-0.4%磷酸(13∶87)為流動相,柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL/min,于327 nm波長處檢測；以綠原酸峰面積為縱坐標(biāo),綠原酸量(μg)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程。并在上述色譜條件下測定對照品溶液及供試品溶液的峰面積。

2.2  流感病毒增毒及其在雞胚上半數(shù)感染量的測定

　　將病毒原液接種于局部消毒后的9日齡SPF雞胚尿囊腔,每胚接種0.1 mL,石蠟封口,33～35 ℃溫箱孵育48 h,4 ℃過夜。收取尿囊液,紅細(xì)胞凝集試驗測血凝滴度。

　　將流感病毒原液系列對數(shù)稀釋(10-1～10-12),分別接種在事先標(biāo)記好的雞胚尿囊腔內(nèi),每個濃度接種4個雞胚,并做生理鹽水對照。將注射了流感病毒的雞胚放入33～35 ℃溫箱內(nèi),48 h后取出,放入4 ℃冰箱內(nèi)過夜；收取尿囊液,每胚0.1 mL依次加入作好標(biāo)記的血凝板上,再加入預(yù)先配制好1%的雞血球0.1 mL,輕搖后40 min觀察結(jié)果,用k·rber公式[2]計算。測得EID50為10-6.28,實驗用100EID50。

　　2.3  金銀花提取物最大不凝血濃度的測定

　　中藥中含有植物血凝素,在體外實驗中往往引起紅細(xì)胞凝集,造成假陽性結(jié)果。因此,應(yīng)用血凝試驗探討中藥體外抑制病毒作用,必須測定中藥的最大不凝血濃度以去除影響因素。處理好的藥液從原濃度始,用pH值7.4的Hank,s工作液2倍系列稀釋6個濃度：2-1～2-6(400～12.5 mg/mL),分別加入等量固定血凝單位的流感病毒,33～35 ℃溫箱中和2 h,測定血凝效價,同時設(shè)Hank,s液對照和病毒對照。結(jié)果測得金銀花提取物不引起血凝的最大濃度為25 mg/mL。

　　2.4  金銀花提取物及利巴韋林注射液對雞胚最大無毒濃度的測定

用含PS 10%的生理鹽水將藥物原液作連續(xù)2倍系列稀釋至1∶512濃度,每次抽取0.2 mL分別接種在預(yù)先作好標(biāo)記的雞胚上,每個濃度接種4個雞胚,并設(shè)生理鹽水對照。將接種好的雞胚放入35 ℃溫箱內(nèi)孵育48 h,每12 h觀察記錄雞胚存活情況,24 h內(nèi)死亡的雞胚不記入藥物毒性作用致死數(shù)。金銀花提取物的最大無毒濃度為100 mg/mL,利巴韋林注射液最大無毒濃度為50 mg/mL。

　　2.5  金銀花提取物不同濃度、不同時間體外抑制病毒作用

　　用pH 為7.4的Hank,s工作液,將金銀花提取物溶液從最大不凝血濃度起作系列2倍稀釋3個濃度,每個濃度4支試管,分別加入等量100EID50的流感病毒,置33～35 ℃溫箱中和1、4、8、14、16、24 h,測各組藥物不同濃度、不同時間點血凝效價,同時設(shè)病毒對照和Hank,s液對照。

　　2.6  金銀花提取物對甲型流感病毒感染雞胚預(yù)防和保護作用

　　2.6.1  預(yù)防作用

　　藥物原液自TD0開始2倍比稀釋3個濃度(100、50、25 mg/mL),每胚0.1 mL分別接種雞胚,每個濃度8個雞胚,37 ℃孵育2 h,并設(shè)生理鹽水和病毒對照；然后分別接種0.1 mL的100EID50的病毒懸液,放入35 ℃溫箱內(nèi)48 h,再4 ℃過夜。抽取尿囊液,測定血凝滴度。

　　2.6.2  治療作用

　　用100EID50病毒懸液接種雞胚,34 ℃孵育2 h,再分別接種與預(yù)防實驗同濃度的藥液,每組8個雞胚,并設(shè)生理鹽水及病毒對照。34 ℃溫箱內(nèi)48 h,再4 ℃過夜。抽取尿囊液,測定血凝滴度。

　　3  結(jié)果

　　(見圖1,表1～表3)表1  金銀花提取物體外直接抑制流感病毒作用(略)表2  不同濃度金銀花提取物對流感病毒感染雞胚預(yù)防作用(略)注：與病毒對照組比較,**P<0.001；與病毒唑組比較,#P<0.05（下同）。表3  不同濃度金銀花提取物對流感病毒感染雞胚治療作用(略)

　　在供試樣品溶液色譜圖中,與對照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上,有一相同保留時間的色譜峰,經(jīng)計算金銀花提取物樣品中綠原酸含量為1.76%。

　　4  討論

　　我們的前期實驗得出銀翹散全方、君藥組和臣藥組均具有抑制流感病毒在小鼠體內(nèi)增殖、保護肺組織的作用。單味藥金銀花提取物抗甲型流感病毒FM1株的體外實驗結(jié)果表明,該藥具有很強的直接殺滅甲型流感病毒FM1株的作用,并且對流感病毒的預(yù)防及治療作用效果顯著。

　　綠原酸是金銀花的主要藥用成分,具有顯著的清熱解毒和抗菌消炎作用,國家藥典也以綠原酸為指標(biāo)控制含量。本實驗采用80%乙醇回流提取方法,去除部分雜質(zhì),得到金銀花粗提物,并通過樣品含量計算,得到金銀花抗流感病毒有效部位中綠原酸含量為1.76%,達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。因此可以推論,綠原酸可能是中藥金銀花抗流感病毒作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

【參考文獻(xiàn)】

  　　[1] 馬丙祥,段曉穎,王志超,等.雙花噴霧劑治療小兒上呼吸道感染臨床與實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2000,20(9)：655.

　　[2] 郭元吉.流行性感冒病毒及實驗技術(shù)[M].北京：中國三峽出版社, 1997.120.