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【關(guān)鍵詞】Caco-2細(xì)胞模型 MDCK細(xì)胞模型 綠原酸 P糖-蛋白 藥動學(xué) 跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)

【文　摘】目的利用Caco-2和MDCK細(xì)胞單層模型研究綠原酸（chlorogenic acid,CGA）的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程及其機(jī)制。方法①Caco-2和MDCK細(xì)胞單層模型建立：Caco-2、MDCK細(xì)胞分別按密度1×10^5、5×10^4個細(xì)胞/cm2接種到Milli-cell-CM culture plate inserts上培養(yǎng),待細(xì)胞單層達(dá)到一定致密程度后進(jìn)行透過實(shí)驗(yàn)。②透過實(shí)驗(yàn)：用M2e酶標(biāo)儀測定CGA在不同方向、不同濃度下的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)情況并計(jì)算累積透過量。結(jié)果在兩種細(xì)胞模型上CGA均有不同程度的雙向跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)（吸收和分泌）,P-gp抑制劑維拉帕米能明顯減少CGA的分泌。結(jié)論CGA跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)同時存在吸收和分泌的動力學(xué)過程。P-gp部分參與CGA的分泌機(jī)制。

綠原酸(chlorogenic acid，CGA)又名咖啡鞣酸，是一種抗氧化性很強(qiáng)的多元酚化合物，它被認(rèn)為是許多清熱解毒類中藥(如金銀花、忍冬藤、魚腥草等)的主要有效成分，藥理作用廣。通常被作為中藥制劑質(zhì)量指標(biāo)之一。

靜脈注射綠原酸后體內(nèi)代謝消除極快，消除半衰期只有十幾分鐘 J，但口服吸收差，在小腸幾乎以原型吸收(水解成咖啡酸的量約1％)，解決CGA應(yīng)用的一個關(guān)鍵是提高生物利用度，而跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力是口服藥物吸收的決定性的環(huán)節(jié)。目前廣泛應(yīng)用的離體藥物吸收模型主要是Caco一2和MOCK細(xì)胞單層模型(以下簡稱Caco一2一M和MOCK-M)。Caco- 2細(xì)胞系來源于人結(jié)腸癌，形態(tài)與人小腸上皮細(xì)胞十分相似，因此能夠很好地預(yù)測藥物的口服吸收能力。Caco-2．M通常用于體外藥物分子腸吸收的研究 J。但Caco一2．M 的建立周期長(需21 d)，而 MOCK細(xì)胞具有生長快的優(yōu)勢，形成完整單層僅1 wk左右。MDCK來源于狗腎上皮細(xì)胞，細(xì)胞亞型少，細(xì)胞膜表面受體的種類和數(shù)量均大大少于Caco一 2細(xì)胞_4j，這種簡單性使MDCK—M的實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性高。有研究發(fā)現(xiàn)MDCK M在研究以被動擴(kuò)散方式經(jīng)腸吸收的藥物時，預(yù)測吸收能力上相對于Caco- 2一M略占優(yōu)勢 J。目前沒有兩種細(xì)胞對于CGA吸收有何差異的研究報(bào)道。本文應(yīng)用MOCK—M研究 CGA跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)情況，并考察維拉帕米(Verapamil， Ver)對其影響，在細(xì)胞、分子水平闡明綠原酸的吸收和分泌過程，并且與Caco．2一M的結(jié)果進(jìn)行比較。

1 材料

1．1 藥品與試劑Caco-2細(xì)胞株和MDCK細(xì)胞株 (ATCC)，MEM 培養(yǎng)液，Trypsin&EDTA混合消化液，Hanks液，PBS液(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)，胎牛血清(FBS，民海生物工程有限公司)， Hepes(Lvshengyuan Biotechnology)，綠原酸(南京替斯艾么中藥研究所，TCM026-080226)，鹽酸維拉帕米注射液(上海禾豐制藥有限公司，071201)，熒光素鈉(上海邁坤化工有限公司，20070520)。

1．2 主要實(shí)驗(yàn)儀器層流超凈工作臺(Stream La— boratory products)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron Cor— poration)，倒置顯微鏡(Nikon Eclipse，TS 100)，酶標(biāo)儀(Spectramax M2e，Molecular Devices)，臺式高速冷凍離心機(jī)(Biofuge primo R，Heraeus)，Millicell— ERS、Millicell—CM culture plate inserts(CPI，Millpore 公司)，細(xì)胞孔培養(yǎng)板(Coming公司)。

2 方法

2．1 細(xì)胞單層模型的建立Caco一2和MDCK細(xì)胞分別按密度1×10 ，5 X 10 個細(xì)胞／cm 孔接種到 24孔CPI中，在37~C，含體積分?jǐn)?shù)為0．05的CO，孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為MEM(pH 7．4，含體積分?jǐn)?shù)為 0．1的FBS、300 mg·L 谷氨酰胺、2 g·ml～NaH— CO3、1×10 U·L 青霉素、1×10 mg·L一鏈霉素)，24 h后更換培養(yǎng)液，以后隔天換液。用Milli． cell—ERS測跨細(xì)胞單層膜電阻(The epithelial electrical resistance，TEER)，熒光素鈉透過率檢測細(xì)胞單層的完整性。實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)l6 J，熒光素鈉的起始濃度為2 g·L～。

2．2 CGA在Caco-2-n 和MDCK-M 上的吸收和分泌

2．2．1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將2 mg CGA溶于2 ml的Hanks緩沖液(含0．01 tool·L～Hepes，下同) 中，配成濃度為100、40、10、5、1．25 mg·L。。的溶液，在327 nm下測定OD值，以O(shè)D值對濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍。

2．2．2 綠原酸的吸收研究 用Hanks溶液稀釋 CGA，使溶液質(zhì)量濃度分別為20、40、80 mg·L～。取符合轉(zhuǎn)運(yùn)條件細(xì)胞單層，pH 7．4的Hanks溶液清洗兩遍，培養(yǎng)30 min，測TEER后加藥。CPI的A側(cè) (細(xì)胞游離側(cè)，Apica1)一B側(cè)(基底側(cè)，Basolatera1) 實(shí)驗(yàn)：A側(cè)分別加入0．2 ml不同濃度的藥物溶液，B 側(cè)加入0．8 ml Hanks溶液，37℃孵箱中培養(yǎng)，每隔 30 min從B側(cè)取樣0．1 ml測OD值，并補(bǔ)充同體積空白底液，以Hanks溶液為對照。為了防止實(shí)驗(yàn)時間過長導(dǎo)致細(xì)胞損傷影響結(jié)果，透過實(shí)驗(yàn)時間維持 3 h，試驗(yàn)結(jié)束時再測TEER，以確定細(xì)胞單層沒有被損傷而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算跨過細(xì)胞單層的CGA濃度，求累積透過量。

2．2．3 綠原酸的分泌研究方法基本同2．2．2，不同的是在CPI的B側(cè)加入待測藥物，A側(cè)加入Hanks 溶液，37℃孵箱中培養(yǎng)，隔30 min吸取A側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)液0．1 ml，測OD值。

2．2．4 維拉帕米對CGA跨膜分泌的影響 方法基本同2．2．3，其中一組含有10一mol·L 的Ver。 2．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析測定值以 ±S表示，采用 GraphPad 5．0軟件包分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3．1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查與TEER測定 在倒置顯微鏡下觀察，Caco．2細(xì)胞生長至d 5～6時達(dá)到融合，生長到10 d后逐漸均勻、致密，邊界清晰，可清楚地看見細(xì)胞之間的界限，到21 d形成致密的細(xì)胞單層；MDCK細(xì)胞生長至3 d開始融合，7 d融合成完整的細(xì)胞單層。細(xì)胞單層的完整性以TEER來確定。 TEER=(TEER測定一TEER空膜)×A；Caco-2 細(xì)胞接種于CPI培養(yǎng)至21 d，測TEER均大于600 Q·am ；MDCK細(xì)胞培養(yǎng)7 d，測定TEER均大于 140 n ·cm ，兩者與文獻(xiàn)結(jié)果一致， ，表明細(xì)胞單層的致密性與完整性足夠良好，可用于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

3．2 熒光素鈉透過率檢查 在CPI上熒光素鈉透過速度很快，前30 min已有20．53％的熒光素鈉透過空白膜，而生長有Caco．2細(xì)胞和MDCK細(xì)胞的膜透過量都只有0．02％，可認(rèn)為基本不透過；2 h內(nèi) Caco一2一M總透過僅為0．62％ ，MDCK—M的總透過僅 0．90％，而空膜已透過20．78％，與文獻(xiàn)結(jié)果一致』，表明兩模型的致密性與完整性足夠好，均可用于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

3．3 綠原酸在Caco-2-M 和MDCK-M 模型上的吸收CGA標(biāo)準(zhǔn)曲線：在1．25 mg·L 至100 mg· L 內(nèi)，，，=0．013 2X一0．009 1；r =0．9 996。 Fig 1結(jié)果表明，在Caco一2-M上CGA累積透過量隨時間延長逐漸增加，且與加入的CGA量呈正變關(guān)系。

Fig 2表明，綠原酸在MDCK．M上吸收更快，達(dá)峰更早(120～150 min左右達(dá)峰值)，劑量增加但峰值增加甚微，40、80 mg·L 兩組曲線接近重合，提示 CGA在MDCK—M上的吸收有飽和特性；其后累積吸收量反而減少。推測CGA可能以主動轉(zhuǎn)運(yùn)方式(分泌)返回A側(cè)，因?yàn)榇藭rA側(cè)的CGA濃度仍大大高于B側(cè)。

3．4 綠原酸在Caco-2-M 上的分泌CGA自細(xì)胞的 B側(cè)跨過細(xì)胞層進(jìn)入Am4是一外排(分泌)過程。 Fig 3A表明CGA在Caco-2一M上的累積分泌量隨時間延長和初始CGA加入量的增多而逐漸增加，40 mg·L-l與80 mg·L 組前60 min分泌量差別明顯，其后二曲線趨于重合，提示有飽和現(xiàn)象，符合主動轉(zhuǎn)運(yùn)特征，這是與吸收過程明顯不同之處。在B側(cè)加入10～tool·L 的Ver，CGA分泌進(jìn)入A側(cè)的影響見Fig 3B，在P—gp抑制劑Ver的作用下各劑量組CGA的累積分泌量均有所減少。 3．5 CGA在MDCK-M 上的分泌Fig 4A表明80 mg·L 組在120 rain、40 mg·L 組在150 min時分泌量達(dá)峰值且維持平衡，二者的量幾乎相等，亦提示飽和特征。

在B側(cè)加入10～mol·L 的Ver，對CGA分泌進(jìn)入A側(cè)的影響見Fig 4B，Ver能減少CGA的外排，對低、中劑量組抑制作用較大，但對高劑量組抑制作用較小。

3．6 P-糖蛋白(P-gp)抑制劑Ver對綠原酸分泌過程的抑制作用在B側(cè)加入10～tool·L 的Ver 進(jìn)行透過實(shí)驗(yàn)，以A側(cè)藥一時間曲線下面積( g· h)為指標(biāo)分析Ver對CGA分泌的影響，結(jié)果見Fig 5。

P—gP可將藥物從細(xì)胞內(nèi)主動排至細(xì)胞外，而藥物外流是造成多種藥物口服無效的重要原因。Fig3，4，5表明，P．gP抑制劑Ver明顯抑制小劑量組 CGA的外排但對高劑量組影響較小。該結(jié)果的可能解釋是：綠原酸的外排有P。gP機(jī)制參與；P—gP對 CGA的外排活性有限，因而對小劑量組效果好；大劑量組CGA的外排有可能通過其他補(bǔ)償機(jī)制(如有機(jī)酸類的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制等)參與，抵消了Ver的作用。

4 討論

通過對CGA在Caco一2一M和MDCK—M上跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)的比較研究，對綠原酸在腸粘膜和腎小管的吸收／重吸收、分泌過程有了較清晰的認(rèn)識。由于Caco-2細(xì)胞是結(jié)腸細(xì)胞，細(xì)胞連接比小腸更為緊密，對靠簡單擴(kuò)散機(jī)制吸收的藥物分子，ca． co-2一M一般都低估其吸收能力。在預(yù)測靠簡單擴(kuò)散機(jī)制跨膜的帶電小分子吸收能力上，MDCK—M可能比Caco-2．M更為合適 J。綠原酸是一種水溶性小分子，我們有資料(待發(fā)表)證明，有一定量CGA經(jīng)被動的脂溶擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)。本文發(fā)現(xiàn)，CGA在MDCK—M上吸收更快更多，支持這一觀點(diǎn)。

CGA在MDCK—M上的吸收有飽和特征，提示有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(transporter)參與。按照權(quán)威教科書 I 觀點(diǎn)，脂溶性小分子物質(zhì)在腎小管以被動(脂溶)擴(kuò)散方式重吸收。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與一般觀點(diǎn)相違，豐富了對腎小管重吸收過程的科學(xué)認(rèn)識。

CGA在兩種細(xì)胞模型上的累積分泌量隨時間延長和初始綠原酸加入量增多而逐漸增加，但這種增加是非線性的，有飽和現(xiàn)象，符合主動轉(zhuǎn)運(yùn)特征，與教科書的分泌為主動轉(zhuǎn)運(yùn)過程的一般觀點(diǎn)一致。腎小管是藥物重吸收與分泌主要場所。就細(xì)胞來源而言，用MDCK—M來了解藥物腎排泄機(jī)制最合適，故本文研究結(jié)果對了解以綠原酸為主要有效成分的中藥制劑藥動學(xué)(經(jīng)腎排泄)有一定參考意義。 CGA為一有機(jī)酸，理論上有可能經(jīng)P一印機(jī)制外排，也可能經(jīng)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(organic anion transporter，OAT)分泌外排 l1]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， P—gP抑制劑Ver能明顯抑制CGA的分泌，表明CGA 的分泌機(jī)制有P—gP參與。但Ver的抑制作用與P— gp的底物(CGA)濃度呈負(fù)相關(guān)：即對低濃度組作用強(qiáng)，但對高劑量組影響小，推測CGA的分泌有多種分子機(jī)制參與，P—Pg參與綠原酸的外排但活性不高，存在室頂現(xiàn)象(ceiling effect)，故P—Pg對低濃度 CGA的外排作用明顯，而高濃度時CGA可能通過其他的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制外排，抵消了Ver的作用，故CGA 濃度高時Ver作用差。我們已有資料(待發(fā)表)初步證明OAT部分參與綠原酸的分泌。

總之，在兩種細(xì)胞模型上，CGA均同時存在吸收／重吸收、分泌過程，P—gP部分參與了CGA的分泌；CGA在腎小管細(xì)胞的重吸收有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與。上述機(jī)制的綜合結(jié)果決定血藥濃度的高低，最終影響藥效。對藥物跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的了解，可在比傳統(tǒng)藥動學(xué)研究更深入的層次上認(rèn)識藥動學(xué)過程進(jìn)而指導(dǎo)聯(lián)合用藥，改善藥動學(xué)過程，如我們發(fā)現(xiàn)雙黃連口服液中的CGA吸收比綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸收更好 (待發(fā)表)，這可能是復(fù)方中存在P。gP抑制劑的結(jié)果。細(xì)胞模型和經(jīng)典藥動學(xué)方法的結(jié)合，應(yīng)是今后藥動學(xué)特別是中藥復(fù)方的藥動學(xué)研究的重要發(fā)展方向之一。