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【摘要】：利用狗腎近端小管上皮(MDCK)細(xì)胞單層模型比較丙磺舒、牛磺酸、青霉素鈉等不同藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物對(duì)雙黃連口服液中綠原酸分泌的影響.MDCK細(xì)胞以1.5×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于Milli-cell-CMculture plate inserts上培養(yǎng),定期觀(guān)察細(xì)胞形態(tài),測(cè)定跨膜電阻值,待細(xì)胞單層達(dá)到一定致密程度后進(jìn)行分泌實(shí)驗(yàn).用M2e酶標(biāo)儀測(cè)定單用雙黃連口服液和合用丙磺舒、�；撬�、青霉素鈉時(shí)各組雙黃連口服液中綠原酸的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)情況,計(jì)算累積分泌量.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,合用不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物后,雙黃連口服液中綠原酸的分泌量均明顯降低.可見(jiàn)綠原酸經(jīng)腎小管上皮細(xì)胞的分泌過(guò)程是一可飽和過(guò)程,有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白部分參與綠原酸的分泌機(jī)制.

【關(guān)鍵詞】： MDCK細(xì)胞模型 綠原酸 有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

雙黃連口服液是由金銀花、黃芩和連翹提取加工制成的口服合劑，為棕紅色的澄清液體，臨床上用于治療風(fēng)熱感冒發(fā)熱、咳嗽、咽痛．綠原酸(Chlo—rogenic acid，CGA)，又名咖啡鞣酸，它被認(rèn)為是許多清熱解毒類(lèi)中藥(如金銀花、忍冬藤、魚(yú)腥草等)抗菌解毒、消炎利膽的主要有效成分，通常被作為中藥制劑的定性甚至定量指標(biāo) ．

MDCK(Madin Darby canine kidney)細(xì)胞系是由Leighton等首先建立，來(lái)源于狗腎遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞 ]，其亞型少，膜表面受體的種類(lèi)和數(shù)量均大大少于Caco一2細(xì)胞 ]，這使MDCK 細(xì)胞模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較而言重現(xiàn)性高 ]，現(xiàn)已被廣泛用于研究物質(zhì)的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)及其機(jī)制．到目前為止，由于方法學(xué)的困難，國(guó)內(nèi)外對(duì)于CGA在細(xì)胞水平上的藥動(dòng)學(xué)研究報(bào)道極少，對(duì)中藥復(fù)方制劑中有效單體成分的藥動(dòng)學(xué)研究則更少．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，合用維拉帕米可抑制小劑量組CGA 的分泌，而CGA 的外排有 P一糖蛋白(P—gP)機(jī)制參與；大劑量組CGA 的外排沒(méi)有影響P-gp對(duì)CGA的外排，大劑量時(shí)CGA 的外排有可能通過(guò)其他補(bǔ)償機(jī)制參與(如有機(jī)酸類(lèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制等)，抵消了維拉帕米的作用，但缺乏進(jìn)一步體的外實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

實(shí)驗(yàn)采用MDCK細(xì)胞模型，利用酶標(biāo)儀測(cè)定雙黃連口服液的有效成分之一— — 綠原酸的跨細(xì)胞分泌量，通過(guò)對(duì)合用不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物后CGA分泌量的比較，探討是否有其它機(jī)制參與CGA在腎小管的分泌過(guò)程，為臨床用藥提供參考依據(jù)．更重要的是為研究復(fù)方中藥藥動(dòng)學(xué)研究進(jìn)行方法學(xué)探索．

1 儀器與材料

層流超凈工作臺(tái)(SCV一4A1，Stream laboratory products)；CO2培養(yǎng)箱(31 1 1，Thermo electron cor— poration)；倒置顯微鏡(I eica，TS 100)；酶標(biāo)儀 (Spectramax M2e，Molecular devices)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Biofuge primor，HERAEUS)；Millicell— ERS跨膜電阻儀，Millicell—CM culture plate inserts (Millipore公司)；24孔和96孔培養(yǎng)板(Corning In— corporated)．

MDCK細(xì)胞株(ATCC)；MEM 培養(yǎng)液，0．25 Trypsin& 0．02 EDTA混合消化液，Hanks液， PBS液，HEPES(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；胎牛血清(FBS)(民海生物工程有限公司)；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 (南京替斯艾么中藥研究所，批號(hào)：TCM026—080226)；雙黃連口服液(哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司，批號(hào)：07121054)；丙磺舒(Probenecid，PBD，濟(jì)南樂(lè)康信藥業(yè)有限公司，批號(hào)：080422)；�；撬�(Taurine，TAU，潛江永安藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：TP08092199)；青霉素鈉(BenzylpenicⅢin Sodium，PCG—Na，華北制藥股份有限公司，批號(hào)：Y0710205)

2 方法

2．1 細(xì)胞單層模型的建立

MDCK細(xì)胞按密度1．5×1O 個(gè)細(xì)胞／TL接種到 24孔Millicell插入式培養(yǎng)吼(cuhure plate inserts， CPI)中，在37℃ ，5 CO 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為 MEM (pH7．4，含胎牛血清1O ，300 mg／I 谷氨酰胺，2 g／mI NaHCO。，100 U／mL青霉素、鏈霉素)， 24 h后更換培養(yǎng)液，以后隔天換液．用Millicell— ERS測(cè)跨膜電阻(The trans—epithelial electrical resistance，TEER)檢測(cè)細(xì)胞單層的完整性．

2．2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備將2 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于2 mL Hanks緩沖液(含10 mmol／I Hepes，下同)中制成母液，用 Hanks緩沖液稀釋?zhuān)�配成質(zhì)量濃度為1O0，40，10，5， 1．25 mg／L的溶液。在327 nrrl下測(cè)定吸光度，以吸光度對(duì)質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，確定線(xiàn)性范圍．

2．3 雙黃連口服液中綠原酸的分泌實(shí)驗(yàn)用Hanks溶液(含10 mmol／I Hepes，下同)稀釋雙黃連口服液原液，使綠原酸的質(zhì)量濃度分別為 20，4O，80 mg／I ．取符合轉(zhuǎn)運(yùn)條件細(xì)胞單層，用pH 7．4的Hanks溶液清洗兩遍，第三遍加Hanks后放人培養(yǎng)箱孵育30 min．測(cè)TEER后加藥．CPI的B 側(cè)(基底側(cè)，Basa1)一A側(cè)(游離側(cè)，Apica1)實(shí)驗(yàn)：按下列分組存B側(cè)加入0．8 mI 不同藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．

(1)對(duì)照組：只加各濃度的雙黃連口服液；(2)丙磺舒(Probenecid，PBD)組：2×l0 mol／I PBD+各濃度的雙黃連口服液 ；(3)牛磺酸(Taurine， TAU)組：1×10 mol／I TAU+各濃度的雙黃連口服液l8 ；(4)青霉素鈉(Benzylpenicillin Sodium， PCG—Na)組：0．2 mol／I PCG～Na+各濃度的雙黃連口服液[8]．各組A側(cè)加入0．2 mI Hanks液，37℃ ， 5 CO 恒溫培養(yǎng)箱下孵育，每隔30 min吸取A側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)液0．1 mI ，進(jìn)行吸光度測(cè)量，并補(bǔ)充同體積空白底液．每組 一3，以Hanks溶液做空白．為了防止實(shí)驗(yàn)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞損傷影響結(jié)果，實(shí)驗(yàn)時(shí)間維持2 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)再測(cè)TEER，以確定細(xì)胞單層有沒(méi)有被損傷而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算跨過(guò)細(xì)胞單層的綠原酸質(zhì)量濃度，求累積分泌量．

2．4 統(tǒng)計(jì)分析

測(cè)定值以z±S表示，采用GraphPad 5．0軟件浙包分析，數(shù)據(jù)用one—way AN0VA 進(jìn)行分析處理檢驗(yàn)是否有差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：a一0．05．

3 結(jié)果

3．1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查

在光學(xué)倒置顯微鏡下觀(guān)察，MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)良好，至第3 d時(shí)開(kāi)始融合，第5 d后細(xì)胞相互交錯(cuò)，第 7 d已融合成完整的細(xì)胞單層． 3．2 細(xì)胞單層的TEER測(cè)定 TEER測(cè)定公式為 TEER= (TEER~ 一TEER空膜)·A 式中，A 為細(xì)胞單層的膜面積，實(shí)驗(yàn)所用的Mi11i— cell-CM CPI膜面積為0．33 cm ．將MDCK細(xì)胞按細(xì)胞單層模型的建立方法培養(yǎng)于Millicell CPI中，每日用電阻儀ERS測(cè)量TEER．與24孔Transwell 上培養(yǎng)7 d后，測(cè)定TEER均大于140 Q·C1TI ，這與文獻(xiàn)結(jié)果一致0]，表明細(xì)胞單層的致密性與完整性足夠良好，可用于藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)．

3．3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在327 nm吸收波長(zhǎng)下測(cè)不同質(zhì)量濃度CGA 的吸光值，以吸光值對(duì)質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2所示．CGA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為一0．013 2z—O．009 1 (R 一0．999 6)

3．4 雙黃連口服液中綠原酸的跨細(xì)胞分泌實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行電阻值測(cè)定，確定細(xì)胞單層生長(zhǎng)的完整性．選取符合實(shí)驗(yàn)要求者進(jìn)行分泌實(shí)驗(yàn)，將測(cè)得的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Y一0．013 2x一0．009 1 得透過(guò)的質(zhì)量濃度，計(jì)算累積透過(guò)量( g)．

綠原酸自細(xì)胞的基底側(cè)跨過(guò)細(xì)胞進(jìn)入A側(cè)是一外排分泌過(guò)程．綠原酸的累積分泌量隨時(shí)間逐漸增加，是一種時(shí)間依賴(lài)性過(guò)程(圖3)．低濃度組在9O ～ 120 min之間出現(xiàn)分泌的累積平臺(tái)，分泌量約為 (O．156±0．020)／xg．根據(jù)CGA分泌的時(shí)間依賴(lài)性特點(diǎn)，接下來(lái)的聯(lián)合給藥實(shí)驗(yàn)都采用90 min的分泌時(shí)間，以保證分泌穩(wěn)態(tài)時(shí)間點(diǎn)的一致性．隨著B(niǎo)側(cè)雙黃連口服液中綠原酸濃度的成倍增加，其累積分泌量差異卻很小(P>0．05)，說(shuō)明分泌過(guò)程不是濃度依賴(lài)性的被動(dòng)擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，而是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(或稱(chēng)為載體)依賴(lài)的可飽和的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程．

3．5 不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物對(duì)雙黃連口服液中綠原酸 跨細(xì)胞分泌的影響

結(jié)果見(jiàn)圖4．PBD明顯抑制CGA的分泌，尤其是小劑量CGA組，減少了54．4 (P<0．001)．中劑量組和高劑量組，PBD 的作用相對(duì)較弱，合用 PBD后CGA 的分泌量分別減少了36．9 (P< 0．01)，38．8 (P

4 實(shí)驗(yàn)討論

藥物經(jīng)腎排泄包括腎小球?yàn)V過(guò)、腎小管重吸收和腎小管分泌．藥物經(jīng)腎小管上皮細(xì)胞直接排入腎小管腔內(nèi)的過(guò)程稱(chēng)為腎小管分泌，一般認(rèn)為該過(guò)程是一主動(dòng)過(guò)程．實(shí)驗(yàn)證明，雙黃連口服液中的綠原酸存在自基底側(cè)向游離側(cè)出胞的分泌過(guò)程．綠原酸為一有機(jī)酸，理論上有可能經(jīng)P一糖蛋白(P—glycopro— tein，P—gP)機(jī)制外排，也可能經(jīng)有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分泌外排l8]．已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P—gP抑制劑維拉帕米_g 能顯著地抑制中、小劑量的雙黃連口服液中綠原酸的外排(對(duì)低劑量組尤為明顯)，對(duì)于高劑量影響甚小，推測(cè)P—gp參與綠原酸的外排但活性不高，綠原酸可能通過(guò)有機(jī)酸(如青霉素)類(lèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制外排．該實(shí)驗(yàn)的目的在于論證這一假設(shè)．MDCK 細(xì)胞為狗。腎近端小管上皮細(xì)胞，MDCK細(xì)胞單層模型是研究藥物跨腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的理想模型．

有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Organic anion transporter， OAT)和轉(zhuǎn)運(yùn)肽家族(Organic anion-transporting poly— peptide family，OATP)，是體內(nèi)排泄有機(jī)陰離子類(lèi)物質(zhì)的重要載體 ]．已知OAT又分為OAT1一OAT5采用競(jìng)爭(zhēng)抑制劑是研究物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要方法．常用的研究有機(jī)陰離子類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的工具藥有丙磺舒、青霉素、�；撬岬龋�丙磺舒為OAT和OATP的底物，能競(jìng)爭(zhēng)性地抑制有機(jī)陰離子的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)[1 ．�；撬崾且环N含硫氨基酸，又稱(chēng)氨基乙磺酸L】 ．青霉素選擇性抑制存在于近曲小管上皮細(xì)胞的基膜側(cè)的 OAT3而對(duì)oAT1作用差L8j．

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)合用不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物后，雙黃連口服液中綠原酸的分泌量均有降低，說(shuō)明它們對(duì)綠原酸的外排分泌有一定的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，其中以青霉素鈉作用最強(qiáng)，提示OAT3介導(dǎo)綠原酸 的分泌．文獻(xiàn)報(bào)道，同時(shí)靜脈給予雙黃連與抗生素時(shí)，綠原酸與抗生素的排泄會(huì)減少『1引，與文中結(jié)果吻合．除0AT和OATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外，腎小管上皮細(xì)胞腔側(cè)面還存在多藥耐藥蛋白P—gp，屬于ATP依賴(lài)型(ATP-binding cassettes，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族[1 ，其作用為促進(jìn)藥物或內(nèi)源性底物從腎小管上皮細(xì)胞向尿液的排泄．筆者發(fā)現(xiàn)P—gP亦參與介導(dǎo)綠原酸的分泌．因此，綠原酸的腎排泄(分泌)過(guò)程可能有P-gp，OAT或OATP等多種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與．

5 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)以雙黃連口服液中的綠原酸為研究對(duì)象，對(duì)復(fù)方中藥中有效成分的跨細(xì)胞分泌機(jī)制做了探討，發(fā)現(xiàn)除了P—gP部分參與綠原酸的外排，還有其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也參與綠原酸的腎排泄過(guò)程，如OAT 或oATP，可見(jiàn)綠原酸的腎小管分泌過(guò)程有多種蛋白介導(dǎo)參與．研究結(jié)果對(duì)了解以CGA 為主要有效成分的中藥制劑藥動(dòng)學(xué)(經(jīng)腎排泄)有一定參考意義．另外，運(yùn)用細(xì)胞模型研究復(fù)方中藥有效成分的藥動(dòng)學(xué)，有可能帶來(lái)中藥藥動(dòng)學(xué)研究的革命性進(jìn)步．

杜仲提取物   綠原酸  金銀花提取物  苦杏仁苷  枇杷葉提取物-熊果酸    大花紫薇提取物-科羅索酸

  淫羊藿苷  二氫楊梅素  獐牙菜苦苷  楊梅素  10-羥基喜樹(shù)堿  7-乙基-10羥基喜樹(shù)堿

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