中藥復(fù)方及單味藥材中淫羊藿苷的大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)分析 | 中藥復(fù)方及單味藥材中淫羊藿苷的大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)分析 |
| 發(fā)布時(shí)間:2011-06-16 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):3162 |
[摘要] 目的:利用反相高效液相色譜法,分別比較復(fù)方與單味藥材提取物中淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)(藥動(dòng)學(xué))參數(shù)差別,探討配伍對(duì)藥效成分體內(nèi)過程的影響。方法:實(shí)驗(yàn)大鼠分別灌胃復(fù)方及單味藥材提取物后,測定不同時(shí)間點(diǎn)血漿中淫羊藿苷的濃度,采用藥動(dòng)學(xué)程序3P97對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)模型擬合并計(jì)算相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果:復(fù)方及單味藥材中淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)分別呈二室和一室模型,主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)為:復(fù)方組Cmax=(3.133±0.290) μg/ml,t1/2(Ka)=(0.753±0.809) h,Tmax=(2.089±0.144) h,AUC0-24=(30.839±3.680) μg·h/ml。單味藥材組Cmax=(2.318±0.218) μg/ml,Tmax=(1.497±0.521) h,AUC0-24=(19.947±2.555) μg·h/ml。結(jié)論:與單味藥材相比,復(fù)方中淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)吸收增加、消除及達(dá)峰時(shí)間延長、血漿清除率減少,因此復(fù)方配伍對(duì)淫羊藿苷體內(nèi)過程有顯著影響。 [關(guān)鍵詞] 藥代動(dòng)力學(xué);淫羊藿;淫羊藿苷;HPLC
復(fù)方肝康顆粒(以下簡稱為“復(fù)方”)是在“乙肝湯劑”的 基礎(chǔ)上，經(jīng)過拆方解方和劑型研究改進(jìn)而來，長期臨床療效表明，該復(fù)方能明顯改善慢性乙肝患者的癥狀和體征，具有 護(hù)肝和抗病毒的作用口1。淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分。 是一種分子式為C H 0()， 的異戊烯基黃酮醇苷類化合物。近年來的研究表明，淫羊藿苷具有多方面藥理作用。主要包括： 心血管方面，在降低心肌耗氧量的同時(shí)降低外周阻力，減輕心臟后負(fù)荷，對(duì)心肌缺血和心律失常等心血管疾病有改善作 用[21，擴(kuò)張血管平滑肌，改善微循環(huán)，對(duì)腦部缺血、低氧有保護(hù) 作用；內(nèi)分泌方面表現(xiàn)為性激素樣作用，具有補(bǔ)腎壯陽作用； 促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖和分化；能增強(qiáng)免疫功能，起到免疫調(diào)節(jié)作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡13l，還具有延緩 衰老、抗疲勞和耐低氧作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成與核酸代謝，對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)作用 。 1試驗(yàn)材料 1．1儀器 北京西東電子高效液相色譜儀LC5500(SPD一10A VP紫 外檢測器。LC—IOAT VP泵，CBM一102 Communication Bus Module工作站，HT一230A柱溫箱)；WH一2微型漩渦混合儀 (上海滬西分析儀器廠有限公司)；TGL16M 高速冷凍離心機(jī) (長沙英泰儀器有限公司)；AFX2—1001一P艾科浦超純水系 統(tǒng)(重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司)；HZ一9811K雙層雙速振蕩 器(上�？等A生化儀器制造廠)；CH1050超級(jí)恒溫槽(上海恒平科學(xué)儀器有限公司)；SKG一02400電熱恒溫干燥箱(黃石市 恒豐醫(yī)療器械有限公司)；XS105 DualRange萬分之一電子天 平(ME1]【’LER TOLEDO，瑞士)；BCD一179K Haier冰箱。 1．2試藥 復(fù)方肝康顆粒(批號(hào)為060305)，復(fù)方所用藥材及淫羊 藿(均購自邵陽藥材公司，淫羊藿批號(hào)為070208)，淫羊藿藥 材提取物(自制)；淫羊藿苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110737—200312)；苯甲酸對(duì)照品(中國藥品生物 制品檢定所，批號(hào)為100419—200301)；肝素鈉(南京新百藥業(yè)有限公司)；乙腈(美國TEDIA公司，色譜純)；冰醋酸(天津化學(xué)試劑有限公司，分析純)；乙酸乙酯(天津化學(xué)試劑有限公司，分析純)；甲醇(天津化學(xué)試劑有限公司，分析純)；重 蒸水(自制)。 1．3試驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠，雄性，體重(200~20)g，由湖南環(huán)境生物 學(xué)院醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物自由攝食自來水和普通 飼料。 2方法與結(jié)果 2．1方法 2．1．1色譜條件色譜柱為Shim-packVP-ODS(4．6mmxl50mm。 5．0 m)，流動(dòng)相為乙腈一3％醋酸(30：70)，檢測波長為 270 nm，流速為1．0 ml／min，內(nèi)標(biāo)為苯甲酸，柱溫為室溫，進(jìn) 樣量為20 1。 2．1．2血漿樣品的處理方法大鼠灌胃前尾靜脈取血1 ml置 于預(yù)先肝素化的試管中，離心(3 000 r／rain，10 min)，取上層 血漿作為空白血漿；取3份空白血漿樣品0．5 ml于10 IIll具 塞離心管中，加入同濃度的淫羊藿苷對(duì)照品溶液100 漩 渦混合均勻，分別比較乙酸乙酯萃取、甲醇和乙腈沉淀法的色譜圖和回收率，最后確定使用乙酸乙酯萃取法處理。 具體步驟如下：取樣品加入2．5 Il1l乙酸乙酯。振蕩萃取 3 rain，離心(5 000 r／min，5 min)，移取上清液，于37℃水浴氮 氣吹干，殘?jiān)尤?00 l甲醇漩渦振蕩1 min溶解，高速離 心(10 000 r／min，2 min)，取上清液20 l進(jìn)樣。 2．1．3藥動(dòng)學(xué)研究取SD大鼠110只。隨機(jī)分為22組。每組 5只，其中，11組給予復(fù)方，另11組給予淫羊藿提取物。實(shí)驗(yàn) 前禁食(不禁水)12 h，第2天按體重灌胃給予復(fù)方(4．30 g，kg) 和淫羊藿提取物[1．64 g(生藥)／kgl，相當(dāng)于淫羊藿苷4．36 ms／ks， 灌胃后于0．25、0．50、0．75、1．00、1．50、2．00、4．00、6．00、8．00、12．00、 24．00 h尾靜脈采血1 ml，置于預(yù)先肝素化的試管中，離心(3 000 r／min，10 min)，取上層血漿0．5 ml放入一20℃冰箱保存?zhèn)溆�，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5只大鼠。按“2．1．2”項(xiàng)下的方法處理后測 定。 2．2分析方法驗(yàn)證 2．2．1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)理論塔板數(shù)按淫羊藿苷計(jì)算不小于 3 000，該峰與其相鄰色譜峰的分離度大于1．5，對(duì)稱因子小 于1．O50 2．2．2方法專屬性0．5 ml空白血漿不加樣．0．5 ml空白血漿 中加入淫羊藿苷和內(nèi)標(biāo)物苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品及0．5 ml給藥后大 鼠血漿，按照“2．1．2”項(xiàng)下方法處理血漿樣品后，分別觀察其色譜行為．結(jié)果表明血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾淫羊藿苷和內(nèi) 標(biāo)物的測定。并且二者峰形良好。淫羊藿苷和內(nèi)標(biāo)物苯甲酸的保留時(shí)間分別為7．1、5．8 min，見圖1。 2．2I3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及最低檢測限測定分別精密量取淫羊藿苷貯備液適量．用甲醇稀釋制成10．200 0、5．100 0、1．020 0、 0．510 0、0．255 0、0．128 0、0．063 8 咖l的淫羊藿苷系列對(duì)照品溶液。于4~C保存?zhèn)溆谩?/FONT> 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制：取500 空白血漿7份，分別加入不同濃度的淫羊藿苷系列對(duì)照品溶液100 Ixl及內(nèi)標(biāo)溶液 50 1，漩渦振蕩混勻后，按“2．1．2”項(xiàng)下操作，分別記錄色譜 圖。以淫羊藿苷與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，淫羊藿苷濃度為橫坐標(biāo)( ，l~g／m1)作圖進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn) 曲線和回歸方程為Y=0．041 3X+0．000 6．r=0．999 7，表明淫 羊藿苷在0．063 8-10．200 0~g／ml范圍內(nèi)線性良好。以信噪比S／N≥3時(shí)的濃度為最低檢測濃度，得方法定量限為 0．063 8 I~g／ml。 2．2．4精密度試驗(yàn)分別取空白血漿500 Ixl。精密加入高、中、 低3個(gè)濃度(濃度分別為l0．20、5．10、O．51 g，rn1)的淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品100 1，同時(shí)加入5O l內(nèi)標(biāo)溶液，按“2．1．2”項(xiàng)下 處理，每一濃度進(jìn)行6個(gè)樣本分析，連續(xù)測定3 d，與標(biāo)準(zhǔn)工 作曲線同時(shí)進(jìn)行血漿樣品的濃度計(jì)算，求得方法的日內(nèi)與日間精密度RSD。日內(nèi)RSD分別為2．33％、3．11％、2．42％；日間 5 分別為3-36％、1．98％、2．75％。 2I2．5提取回收率分別取空白血漿500 l，精密加入高、中、 低3個(gè)濃度(濃度分別為10．2O、5．10、0．51~g／m1)的淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品100 l，每個(gè)濃度各6樣本，按“2．1．2”項(xiàng)下操作， 測得血漿樣品濃度。以樣品經(jīng)提取后的色譜峰面積與未經(jīng)提取直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積之比．考察樣品的提取回 收率及其兄。高、中、低3個(gè)濃度的回收率分別為93．88％、 90．82％、87．42％；RSD分別為2．17％、lI49％、1．84％。 2．2．6穩(wěn)定性試驗(yàn)取空白血漿500 txl，精密加入高、中、低 3個(gè)濃度(濃度分別為10．2O、5．10、0．51 g／m1)的淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品100 1及內(nèi)標(biāo)溶液50 ，每個(gè)濃度各6樣本， 按“2．1．2”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣20 l記錄樣品的峰面積，剩余樣本置于室溫保存(約28oC)，于6、12、24 h后重新測定， 將3個(gè)濃度各時(shí)間點(diǎn)測得的峰面積比進(jìn)行對(duì)照，計(jì)算 RSD(％)。測得10．20、5．10、0．51~glml樣品的RSD分別為 2．43％、5．36％、7．73％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血漿樣品經(jīng)處理于室溫保存24 h后，血漿中淫羊藿苷濃度仍可被準(zhǔn)確測 定。 2．3藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果 將測得的血藥濃度數(shù)據(jù)采用3P9 實(shí)驗(yàn)藥動(dòng)學(xué)計(jì)算機(jī)程 序，對(duì)血藥濃度一時(shí)問數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，根據(jù)AIC最小的原則選 取房室模型，兩組聞的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較采用兩樣本總體均數(shù) t檢驗(yàn)。復(fù)方及淫羊藿中淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)分別呈二室和 一室模型，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表l，其平均藥一時(shí)曲線見 圖2。 3討論 3．1血漿樣品的處理 先后采用乙酸乙酯萃取。甲醇、乙腈沉淀來處理樣品，發(fā) 現(xiàn)與甲醇和乙腈沉淀處理相比，用乙酸乙酯處理的樣品所含內(nèi)源性干擾物少．樣品的回收率較高．結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道 一致，有研究者曾用甲醇提取獲得了理想的結(jié)果罔，但使用甲醇 沉淀易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。對(duì)乙酸乙酯使用量和萃取次數(shù)的考察中，曾用0．5 ml血漿加入1．5、2．5、3．0 IIll進(jìn)行1次及2次萃取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用2．5 rIIl及3．0 ml的提取率高于1．5 IIll，但 2．5 IIll與3 Hl1之間幾無差別，分1次和2次萃取提取率差別不大，因此選用乙酸乙酯1次萃取。既方便又節(jié)省溶劑且揮 干時(shí)間較短。經(jīng)方法學(xué)證實(shí)，該方法確有較高的靈敏度和專屬性，以及良好的精密度和準(zhǔn)確度，符合生物樣品分析方法 的要求。 3．2淫羊藿苷的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn) 各時(shí)間點(diǎn)血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)3P97藥動(dòng)學(xué)軟件擬合分析 后，得出復(fù)方中淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)均呈二室模型，淫羊藿提取物中淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)呈一室模型。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分 析：復(fù)方和淫羊藿提取物大鼠灌胃后。淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)的吸收滯后時(shí)間(Lag time)分別為0．347、0．271 h。動(dòng)物給藥后復(fù)方組吸收入血的速度較慢；兩組藥物的吸收速率常數(shù)l(1 分別為1．119、2．192，說明淫羊藿提取物組吸收的速度較快，而復(fù)方組吸收的速度較慢；兩組消除半衰期比較，服用復(fù)方 組動(dòng)物體內(nèi)的淫羊藿苷消除相對(duì)較慢；血漿藥物峰濃度( ) 分別3．133、2．318，曲線下面積 uc)值分別為30．839、19．947，復(fù)方組的吸收程度較淫羊藿提取物組好；血漿清除率(CL)、 表觀分布容積(Vd)。淫羊藿提取物組相對(duì)較大。兩組間的差 別經(jīng)t檢驗(yàn)得出，Cl膃、AUC、CL、Vd、疋、t (P<0．O1)， (P< 0．05)，說明復(fù)方與淫羊藿提取物的 存在顯著性差異，在 Cm、AUC、CL、 、疋、‘I儺 之間有非常顯著性差異。此結(jié)果顯示。復(fù)方中淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)較淫羊藿提取物的吸收明顯 增加，藥物峰濃度增高，消除及達(dá)峰時(shí)間延長，血漿清除減少，藥物體內(nèi)作用的時(shí)間延長，單味藥提取中的淫羊藿苷體 內(nèi)分布較廣。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，淫羊藿苷的生物利用度僅為12％ ，隨著灌胃劑量的增加，并不能明顯提高其血藥濃度，且吸收 情況較差，原因可能是由于高劑量時(shí)淫羊藿苷的溶解度降低，藥物難以經(jīng)胃腸道吸收。趙艷紅等[10-11研究了淫羊藿苷大 鼠腸內(nèi)吸收的機(jī)制，表明淫羊藿苷先被水解再吸收，高劑量灌流時(shí)有少部分以原型形式吸收；另有學(xué)者[121將淫羊藿總黃 酮制成磷脂分散物后．使淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)的吸收增加，藥時(shí)曲線下積分面積似wc)提高2．5倍，峰濃度提高3倍。本 研究的結(jié)果表明通過改變劑型，增加總黃酮的溶解，提高親脂性，將有效提高淫羊藿苷在體內(nèi)的吸收，由此推測復(fù)方本 身存在，或是在煎煮制備的過程中產(chǎn)生了某些新成分，這些成分與淫羊藿苷作用后。增加了淫羊藿苷的溶解度及親脂 性，使得其在大鼠體內(nèi)的吸收增加，生物利用度提高，具有協(xié)同增效的作用。 上述研究證明．中藥復(fù)方成分在體內(nèi)的變化是一個(gè)復(fù)雜 的過程。復(fù)方中各成分對(duì)淫羊藿苷在體內(nèi)有促進(jìn)吸收、協(xié)同增效的作用。同時(shí)進(jìn)一步證實(shí)了中藥復(fù)方配伍應(yīng)用的科學(xué)性所在。 杜仲提取物 綠原酸 金銀花提取物 苦杏仁苷 枇杷葉提取物-熊果酸 大花紫薇提取物-科羅索酸 淫羊藿苷 二氫楊梅素 獐牙菜苦苷 楊梅素 10-羥基喜樹堿 7-乙基-10羥基喜樹堿 上禾生物 專注植提 精于高純 基于您對(duì)天然產(chǎn)物需求持續(xù)創(chuàng)新 |
