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【摘要】 為優(yōu)化金銀花中綠原酸的超聲提取工藝,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇超聲提取時(shí)間、提取溶劑量、乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量,綠原酸得率作為響應(yīng)值,采用中心組合設(shè)計(jì)的方法,研究各自變量及其交互作用對綠原酸提取的影響。采用響應(yīng)面分析軟件,模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測模型,并確定超聲提取最佳工藝條件為提取時(shí)間25.55 min/次,提取溶液量為10.87倍,乙醇體積分?jǐn)?shù)為71.46%,綠原酸的平均得率為2.03%。

【關(guān)鍵詞】 金銀花；綠原酸； 響應(yīng)面分析； 超聲提取

金銀花為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的干燥花蕾或初開的花，在我國分布較廣，藥用歷史悠久，為常用的清熱解毒藥。它也是國家衛(wèi)生部首批頒布的既是食品又是藥品的60種中藥之一¨J。金銀花中富含多種對人體健康有益的營養(yǎng)物質(zhì)，如揮發(fā)油、黃酮及綠原酸類、 萜類和微量元素等。其中綠原酸是金銀花中主要活性成分之一， 是植物在有氧呼吸過程中產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，抗氧化能力強(qiáng)，還具有抗艾滋病毒、抗腫瘤細(xì)胞、抗致畸、抗過敏及抗氧化、清除自由基等功能。

響應(yīng)曲面法是Box等人提出的一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的有效方法 J，已被廣泛用于生物過程的優(yōu)化，但在綠原酸提取工藝研究方面的報(bào)道較少。本研究以綠原酸的提取率為響應(yīng)因子，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對超聲提取過程中的各主要因素采用響應(yīng)面法進(jìn)行了優(yōu)化，確定出金銀花中綠原酸提取的最佳工藝參數(shù)，為產(chǎn)業(yè)化提供理論保障。

l 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 試劑與儀器

綠原酸對照品(批號(hào)1 l07l5-2o0912，供含量測定用)購于中國藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純；水為市售娃哈哈純凈水，經(jīng)0．45 tgn微孔濾膜過濾；冰醋酸、95％乙醇為分析純；金銀花購自百姓緣大藥房，生產(chǎn)批號(hào)為201001 14，產(chǎn)地山東。 Sartorius BS22S型電子天平；KQ5200B型超聲波清洗儀；UV一1800型紫外可見分光光度計(jì)；isi— lent1200系列液相色譜儀。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 綠原酸的提取 準(zhǔn)確稱取金銀花粗粉 3．O0 g，加入一定量的提取溶液浸泡12 h，在超聲波條件下提取綠原酸，提取溫度為5O℃，提取2次，然后抽濾，收集濾液，將濾液用提取溶劑定容至一定體積待測。

1．2．2 綠原酸的含量測定采用紫外分光光度法對綠原酸進(jìn)行定性分析，在200～400 nm波長對綠原酸對照品進(jìn)行掃描，得出其最大紫外吸收波長 327 nm，并以此為檢測波長，采用高效液相色譜法進(jìn)行定量分析。

1．2．2．1 色譜條件Hypersil BDS C18柱(5 m， 4．0 mm×250 mm，大連依立特，柱號(hào)E1618859，批號(hào)11001)；流速1．0 mL／min；甲醇-0．6％ 冰醋酸水溶液(15：85)為流動(dòng)相；檢測波長327 Flm；柱溫 25．0℃ 。理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)不低于1 000。

1．2．2．2 對照品溶液的制備精密稱取綠原酸對照品3．7 mg至l0 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

1．2．2．3 樣品溶液的制備精密量取提取樣品 2．0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。

1．2．2．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取對照品溶液

1，2，4，6，8，l0 ，分別注入液相色譜儀中，測定其峰面積。以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，計(jì)算得回歸方程。

1．2．3 單因素實(shí)驗(yàn)分別以不同的超聲提取時(shí)間、提取溶劑量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取功率等為因素，考察各因素對綠原酸提取工藝的影響。

1．2．4 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲提取時(shí)間、提取溶劑量、乙醇體積分?jǐn)?shù)等因素作為考察對象，以綠原酸得率為響應(yīng)值，采用 Design Expert 7．0．0統(tǒng)計(jì)分析軟件的響應(yīng)面法安排實(shí)驗(yàn)，以獲取最優(yōu)化工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2．1 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=2 362C+32．151(r=0．999 7，lq=6)，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。綠原酸進(jìn)樣量在0．37～3．7 g范圍內(nèi)線性關(guān)系較好。

2．2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．2．1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果的影響由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，綠原酸 的提取得率先增加后降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)在70％時(shí)，綠原酸得率達(dá)到最大值。這是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)過低時(shí)綠原酸不能很好地溶出，而體積分?jǐn)?shù)過高又會(huì)將雜質(zhì)等一起溶出。

2．2．2 提取溶劑量對提取效果的影響

由圖3可知，隨著提取溶劑量的增加，綠原酸的提取得率增加，但是溶劑用量在lO倍以上時(shí)，綠原酸得率變化不大。提取溶劑越大，細(xì)胞內(nèi)外的濃度差越大，傳質(zhì)推動(dòng)力也越大，內(nèi)擴(kuò)散的速度越大，越有利于綠原酸的溶出。當(dāng)提取溶劑量達(dá)到1：10 時(shí)，已經(jīng)基本達(dá)到平衡。

2．2．3 提取時(shí)間對提取效果的影響 由于超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)的影響，破壞植物藥材的細(xì)胞，使得溶劑很快地滲透到細(xì)胞內(nèi)部，而使細(xì)胞中的化學(xué)成分很快溶于溶劑中，同時(shí)加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解，所以超聲波提取通常比常規(guī)提取時(shí)間要短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的增加，綠原酸的提取得率先增加后降低，當(dāng)超聲處理25 min，綠原酸得率達(dá)到最大值。后期所出現(xiàn)的有所下降的趨勢，主要是因?yàn)殡S著時(shí)間的增大，可溶性成分溶出的就越多，使得提取液粘度增大，在后期操作中有所損耗。

2．2．4 超聲提取功率對提取效果的影響 當(dāng)功率增大時(shí)，對植物細(xì)胞破碎作用加大，加速有效成分的溶解，綠原酸得率隨超聲功率的升高而增加，因此，超聲提取功率選擇200 W，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

2．3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝

2．3．1 Box—Behnken設(shè)計(jì)方案根據(jù)Box—Benhnken 的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取時(shí)間、提取溶劑量、乙醇體積分?jǐn)?shù)對綠原酸提取影響顯著的3個(gè)因素，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法。分析因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

對提取時(shí)間、提取溶劑量、乙醇體積分?jǐn)?shù)作如下變換X ：(t一25)／5，X =(Z一10)／2，X3=(C一 7O)／10。式中，￡、Z、C分別表示提取時(shí)間、提取溶劑量、乙醇體積分?jǐn)?shù)，以綠原酸得率為響應(yīng)值l，(％)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2．3．2 方差分析和回歸方程及回歸方程各項(xiàng)的方差分析采用Design expert程序?qū)λ�得�?shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，回歸分析結(jié)果見表3。從表3中可以看出，方差分析結(jié)果中， ， ，霉， 和霹項(xiàng)影響顯著，說明各個(gè)具體實(shí)驗(yàn)因子與響應(yīng)值都不是簡單的線性關(guān)系。

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，確立如下回歸方程預(yù)測模型： Y=2．O1+0．027X1+0．036 X2+0．031 + 0．002 5 1X2—0．007 5 XlX3—0．020 X2 一0．12 一0．038 X；一0．073 X；該模型的R =0．92，說明此模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，實(shí)驗(yàn)失擬項(xiàng)小，因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。對提取率影響的大小依次為提取溶劑量、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間。

2．3．3 響應(yīng)面圖分析 圖6～圖8直觀的給出了各個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面圖�？梢钥闯�，提取時(shí)間、提取溶劑量、乙醇體積分?jǐn)?shù)對響應(yīng)值的影響均較大，表現(xiàn)為曲線比較陡，這與回歸分析的結(jié)果吻合。 2．3．4 最優(yōu)工藝條件求取為了進(jìn)一步確證最佳點(diǎn)的值，對回歸方程取一階偏導(dǎo)等于0，可以得到曲面的最大點(diǎn)，求導(dǎo)方程整理得： 0．027+0．002 5 X2—0．007 5恐一0．24 Xl=0 0．036-4-0．002 5 X1—0．020 X3—0．076 X2=O 0．003 1—0．007 5 X1—0．020 X2—0．146 X3=0 求解方程組得：A=0．112 5，B=0．438 8，C= 0．146 4。最后求得超聲提取時(shí)間、提取溶劑量和乙醇體積分?jǐn)?shù)的最適值分別為：a=25．55 min，b= lO．87倍，c=71．46％。此時(shí)，綠原酸的理論提取率為2．02％。

經(jīng)過中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件，最佳的提取工藝參數(shù)為：超聲提取時(shí)間為25．55 min，提取溶液量為10．87倍，乙醇體積分?jǐn)?shù)為71．46％ ，此時(shí)綠原酸提取率的理論值可達(dá)到2．02％。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，提取率為2．03％，與理論值相符。因此，采用響應(yīng)面法得到的提取條件參數(shù)相對較為可靠，具有使用價(jià)值。

3 結(jié)論

(1)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用通過中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，優(yōu)化金銀花中綠原酸的超聲提取條件。建立了數(shù)學(xué)回歸模型Y：2．01+ 0．027X】+0．036 X2+0．031 +0．002 5 X X2— 0．007 5 X1X3—0．020 X2X3—0．12 一0．038 一 0．073 X；。本模型能較準(zhǔn)確地預(yù)測綠原酸的提取率。

(2)通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到綠原酸的最優(yōu)提取條件為：加人一定量的提取溶液浸泡12 h，提取溫度為50 ℃ ，提取2次，超聲提取時(shí)間為 25．55 rain／次，提取溶液量為10．87倍，乙醇體積分?jǐn)?shù)為71．46％ ，綠原酸的平均得率為2．03％。 

杜仲提取物   綠原酸  金銀花提取物  苦杏仁苷  枇杷葉提取物-熊果酸    大花紫薇提取物-科羅索酸

  淫羊藿苷  二氫楊梅素  獐牙菜苦苷  楊梅素  10-羥基喜樹堿  7-乙基-10羥基喜樹堿

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