黃連提取物黃連素與腸道菌群的相互作用研究
人體胃腸道中棲息著大量微生物，組成極其復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，維持腸道穩(wěn)態(tài)，在人體健康中發(fā)揮重要作用[1-2]。腸道菌群參與多數(shù)口服藥物的體內(nèi)代謝，中藥及其復(fù)方傳統(tǒng)應(yīng)用多為口服給藥，不可避免地與腸道菌群相互接觸，導(dǎo)致化學(xué)成分在肝臟首關(guān)效應(yīng)之前發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，藥物的活性或毒性發(fā)生明顯改變，影響藥效的發(fā)揮[3-4]。此外，近年來(lái)大量研究證實(shí)腸道菌群紊亂會(huì)導(dǎo)致腸道致病菌急劇增殖，促進(jìn)結(jié)腸炎、肥胖癥、糖尿病及其并發(fā)癥、心血管疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[5-7]。由此可見(jiàn)，以腸道菌群為靶點(diǎn)的藥物干預(yù)將為疾病的預(yù)防及臨床治療提供新的策略。
黃連為毛茛科多年生草本植物，臨床上以其干燥根莖入藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，常用于腹瀉、糖尿病及其并發(fā)癥等疾病的治療，臨床療效顯著[10]。現(xiàn)代研究表明，黃連主要含有小檗堿、黃連堿、巴馬汀等生物堿類活性成分，目前僅有少量關(guān)于單體小檗堿的腸道菌群代謝研究[11]，黃連與腸道菌群的相互作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。而中藥及其復(fù)方往往通過(guò)多組分、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的整體調(diào)節(jié)作用，因而開(kāi)展黃連提取物 與腸道菌群的相互作用探討，為黃連體內(nèi)代謝吸收及作用機(jī)制的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料
1.1 儀器與試劑
UPLC（Waters公司）；Q-TOF-MS（Waters公司）；高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；4種選擇性培養(yǎng)基：乳酸菌LBS瓊脂培養(yǎng)基（編號(hào)HB0385）、雙歧桿菌BS瓊脂培養(yǎng)基（編號(hào)HB0394）、腸球菌培養(yǎng)基（編號(hào)HB0133）、伊紅美蘭培養(yǎng)基（編號(hào)HB0107）均購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司。
1.2 藥材
黃連飲片（批號(hào)17010）購(gòu)自安徽慧隆中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為Coptis chinensis Franch。
1.3 普通厭氧培養(yǎng)基（GAM）
0.15 g巰基乙酸鈉、0.15 g L-無(wú)水巰基丙氨酸鹽酸鹽、0.6g牛肉浸出粉、1.1 g牛肉膏、1.25 g磷酸二氫鉀、1.5 g大豆胨、1.5 g葡萄糖、1.5 g氯化鈉、2.5 g可溶性淀粉、2.5 g酵母淀粉、5.0 g 蛋白胨、5.0 g朊蛋白胨、6.15 g消化血清、500 mL純水。
2 方法
2.1 黃連提取物的制備
稱取黃連適量，加入8倍量水，浸泡1 h，煎煮30 min，濾過(guò)，濾渣繼續(xù)用6倍量水煎煮30 min，濾過(guò)，合并2次濾液，濾液減壓濃縮至生藥質(zhì)量濃度1.0 g/mL，備用。經(jīng)檢測(cè)黃連提取物中小檗堿、黃連堿、巴馬汀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（123.92±0.65）、（16.74±2.58）、（16.09±0.39）mg/g。
2.2 腸道菌群的培養(yǎng)
收集正常人新鮮糞便5.0 g，與生理鹽水按比例1∶4比例混合，渦旋2 min，制成混懸液，1 000 r/min離心10 min后，得上清液，即為腸道菌液。將腸道菌液用無(wú)菌生理鹽水連續(xù)稀釋，吸取0.1mL適當(dāng)?shù)南♂屢悍謩e接種在相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基平板上，均勻涂布，并在37 ℃厭氧培養(yǎng)。分別進(jìn)行腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的選擇性培養(yǎng)。將以上分離得到的各種細(xì)菌冷凍保存在4 ℃冰箱，備用。取0.1 mL冷凍保存的健康人腸道菌液至0.9 mL GAM中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，將活化后的菌液渦旋混勻，采用無(wú)菌生理鹽水稀釋，調(diào)整菌液濃度為1×107個(gè)/mL，備用。
2.3 腸道細(xì)菌對(duì)黃連提取物的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化液的處理
取0.1 mL腸道菌群稀釋液，加入到0.9mL GAM中，再加入0.1 mL適當(dāng)質(zhì)量濃度的黃連提取物，以GAM培養(yǎng)液為對(duì)照組，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，用1.5倍量的醋酸乙酯萃取，萃取液離心濃縮后，供UPLC-Q-TOF-MS分析。
2.4 黃連提取物對(duì)4種細(xì)菌生長(zhǎng)的影響
取100 μL（濃度為1×107個(gè)/mL）4種腸道菌液（乳酸菌、雙歧桿菌、腸桿菌、腸球菌）分別加入到1.0 mL含不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、2.0 g/mL）黃連提取物的GAM培養(yǎng)液中，以不含藥的菌懸液作為對(duì)照組，每組處理重復(fù)3份，37 ℃厭氧培養(yǎng)，600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度（A）值，直到細(xì)菌生長(zhǎng)到達(dá)穩(wěn)定期。
2.5 黃連提取物轉(zhuǎn)化前后的UPLC-Q-TOF-MS分析
2.5.1 UPLC條件 色譜柱為Acquity UPLC Syncronis C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～3 min，80%～75% A；3～4 min，75%～70% A；4～6 min，70%～55% A；6～10 min，55%～20% A；10～11 min，20% A；11～12 min，20%～80% A。體積流量0.4mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣器溫度4 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)時(shí)間12 min。
2.5.2 質(zhì)譜條件 ESI源；數(shù)據(jù)采集模式和方式：MSE和Centroid，正離子模式；MS參數(shù)：離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度400 ℃，毛細(xì)管電壓4.0 kV，錐孔電壓40 V，脫溶劑氣體積流量600 L/h，錐孔氣體積流量50 L/h；質(zhì)量掃描范圍100～1 000 m/z；采用MetabolynxTM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
3 結(jié)果
3.1 黃連提取物經(jīng)腸道細(xì)菌代謝的UPLC-MS圖譜分析
采用UPLC-Q-TOF/MS測(cè)定黃連提取物經(jīng)腸道細(xì)菌的轉(zhuǎn)化液，未轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化后黃連提取物的總離子流圖見(jiàn)圖1，數(shù)據(jù)經(jīng)MetabolynxTM軟件分析后，腸道細(xì)菌對(duì)黃連提取物的代謝產(chǎn)物見(jiàn)表1。通過(guò)比較孵育組和對(duì)照組總離子流圖的保留時(shí)間（tR）、相對(duì)分子質(zhì)量及質(zhì)譜斷裂規(guī)律，結(jié)果表明，孵育組含有未完全代謝的原型小檗堿、黃連堿和經(jīng)過(guò)腸道細(xì)菌代謝而形成的氫化小檗堿、氫化黃連堿，尤其是大量的小檗堿發(fā)生了氫化作用；此外，去甲氧基作用有助于提高化合物的穩(wěn)定性，如姜黃素去甲氧基、去二甲氧基后，穩(wěn)定性依次增強(qiáng)，且tR值依次是去二甲氧基姜黃素＜去甲氧基姜黃素＜姜黃素[12-13]，故初步推測(cè)巴馬汀經(jīng)腸道細(xì)菌代謝為去甲氧基巴馬�。▓D2）。
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3.2 黃連提取物對(duì)腸道菌群生長(zhǎng)的影響
采用濁度測(cè)定法觀察不同質(zhì)量濃度黃連提取物對(duì)4類腸道細(xì)菌（腸桿菌、腸球菌、乳酸菌、雙歧桿菌）生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示，黃連提取物對(duì)病原菌如腸球菌和腸桿菌具有顯著的抑制作用，且抑制作用隨質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)；對(duì)益生菌如雙歧桿菌和乳酸菌具有顯著的促進(jìn)作用，且促進(jìn)作用隨質(zhì)量濃度升高而增強(qiáng)（圖3）。
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4 討論
4.1 腸道菌群代謝作用影響中藥藥效
腸道細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生水解酶、氧化還原酶、裂解酶、轉(zhuǎn)移酶等多種多樣的酶類，可進(jìn)行水解、還原、甲基化、乙�；�、脫糖基等一系列生化反應(yīng)，從而顯著影響中藥各類成分的體內(nèi)吸收及生物活性[14]。如一些中藥成分經(jīng)腸道菌群代謝后形成前藥而發(fā)揮效應(yīng)，麥冬皂苷D被大鼠腸道菌群代謝為薯蕷皂苷元，從而易于吸收入血[15]；人參皂苷Rg3和Rh2通過(guò)腸道菌群的脫糖基作用，形成具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的原人參二醇[16-17]。目前胃腸道的首關(guān)效應(yīng)已引起廣泛重視，開(kāi)展腸道菌群對(duì)中藥成分的代謝研究，闡釋其在體內(nèi)的代謝過(guò)程，有助于揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。
黃連的主要活性成分為小檗堿、黃連堿、巴馬汀等生物堿類成分，但該類成分吸收差，血藥濃度低，生物利用度低[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連生物堿類成分可被腸道菌群代謝為氫化小檗堿、氫化黃連堿和去甲氧基巴馬汀。小檗堿水溶性差，而其代謝產(chǎn)物氫化小檗堿的極性變大，脂水分配系數(shù)得以改善，易于吸收入血。朱志勇[20]在大鼠ig小檗堿后的尿液中發(fā)現(xiàn)小檗堿氫化產(chǎn)物的硫酸結(jié)合型和葡萄糖醛酸結(jié)合型代謝產(chǎn)物，且另有研究表明小檗堿的氫化產(chǎn)物與小檗堿共同發(fā)揮藥效[21]；黃連堿極難溶于水，大鼠ig黃連堿后的血液中發(fā)現(xiàn)氫化黃連堿，且在尿液中發(fā)現(xiàn)葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物和硫酸酯化產(chǎn)物[22-23]，而氫化黃連堿具有調(diào)血脂、降血糖等作用[24]；巴馬汀去甲氧基反應(yīng)后，其代謝物可與巴馬汀共同發(fā)揮藥效[25]。由此可見(jiàn)，腸道菌群的代謝作用對(duì)于黃連生物堿類成分的體內(nèi)吸收及藥效的發(fā)揮起著重要作用，但參與黃連代謝的特定細(xì)菌種類及其產(chǎn)生的酶系仍不清楚，因此后續(xù)研究將加強(qiáng)黃連生物堿類成分代謝過(guò)程中腸道細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)與功能的研究，闡明其代謝過(guò)程中何種細(xì)菌分泌何種酶參與哪些具體的代謝環(huán)節(jié)，從而有助于揭示腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)化黃連化學(xué)成分的機(jī)制。
4.2 腸道菌群可能成為中藥發(fā)揮效應(yīng)的作用靶點(diǎn)
腸道為腸道菌群提供了優(yōu)越的棲息與繁殖的環(huán)境，滿足其所需的各種生理?xiàng)l件，正常的腸道菌群對(duì)宿主的消化、吸收、營(yíng)養(yǎng)、代謝、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、生物拮抗等方面具有積極的生理作用[26]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究顯示，人體腸道菌群紊亂與肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)[27-29]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者體內(nèi)產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌豐度顯著下降，而各種條件致病菌明顯增加[30]。益生菌的水平大幅降低，有害菌水平大幅提高，進(jìn)而引發(fā)全身慢性低度炎癥，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)一步干預(yù)胰島素信號(hào)的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致2型糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。因此，基于腸道微生態(tài)研究將有助于揭示黃連干預(yù)糖尿病及其并發(fā)癥的作用機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連提取物可明顯促進(jìn)益生菌（乳酸菌、雙歧桿菌）的生長(zhǎng)，顯著抑制病原菌的生長(zhǎng)，且調(diào)控作用與劑量呈正相關(guān)性。已有研究表明，乳酸菌具有明顯改善糖尿病模型大鼠的病理癥狀[31-32]。而腸道病原菌過(guò)度繁殖，產(chǎn)生大量?jī)?nèi)毒素，使腸道通透性增加，導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素血癥，最終引起多臟器功能衰竭[33-34]。由此可見(jiàn)，黃連具有調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)[35]、改善腸道微生態(tài)、促進(jìn)腸道健康的功能，有望實(shí)現(xiàn)有效干預(yù)糖尿病及其并發(fā)癥等慢性疾病的發(fā)生發(fā)展。
參考文獻(xiàn)（略）
來(lái) 源：崔 祥，陶金華，江 曙，魏曉燕，徐 君，錢大瑋，段金廒. 黃連提取物與腸道菌群的相互作用研究 [J]. 中草藥, 2018, 49(9):2103-2107.
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