貓爪草提取物體外抗腫瘤作用的研究－上禾生物 | 貓爪草提取物體外抗腫瘤作用的研究－上禾生物 |
| 發(fā)布時(shí)間:2021-10-06 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):740 |
| 為探討貓爪草不同提取物對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的作用，采用系統(tǒng)溶劑法提取貓爪草皂苷及多糖，運(yùn)用MTT和集落形成實(shí)驗(yàn)法觀察不同濃度的皂苷及多糖對體外培養(yǎng)的肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)貓爪草皂苷及多糖對三種腫瘤細(xì)胞株的生長和集落形成均有不同程度的影響，皂苷給藥量與抑瘤率和集落形成明顯地呈正相關(guān)關(guān)系，而多糖有一最佳濃度。 關(guān)鍵詞 貓爪草;皂苷;多糖;體外抗腫瘤;MTT法 貓爪草Radix ranunculus ternati系毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根,具散結(jié)、消腫之功，可用于治療瘰疬、淋巴結(jié)核未潰、肺結(jié)核、淋巴結(jié)炎、咽喉炎、癤病、腫瘤等疾病[1,2]。經(jīng)多年臨床驗(yàn)證，貓爪草對惡性淋巴瘤、甲狀腺瘤和乳腺腫瘤等具有較好的效果[3,4]，但有關(guān)貓爪草抗腫瘤的有效成分及作用機(jī)制尚不清楚。鑒于貓爪草入藥常以水煎煮用之，且經(jīng)初步預(yù)試，貓爪草中皂苷及多糖含量較高。為此本實(shí)驗(yàn)采用系統(tǒng)溶劑提取法對貓爪草皂苷及多糖進(jìn)行提取，研究其對體外培養(yǎng)的肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的作用，以尋找貓爪草抗腫瘤的有效部位及作用機(jī)理，為臨床治療腫瘤提供理論依據(jù)。 1、材料 圖片 1.1藥材 貓爪草，購自濟(jì)南市建聯(lián)藥店，產(chǎn)地為河南信陽，經(jīng)姚廷芝主任藥師鑒定為毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根。5-氟脲嘧啶(上海制藥十二廠提供，批號20020125)。 圖片 圖片 1.2細(xì)胞株 肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7均由山東中醫(yī)藥大學(xué)腫瘤研究中心提供。 圖片 圖片 1.3試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液(美國Gibco產(chǎn)品)、FCS(小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品)、MTT(Sigma公司產(chǎn)品)、D-Hanks液、DMSO(二甲基亞砜)、乙醇、乙醚、正丁醇等。 圖片 圖片 1.4儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋公司)、超凈工作臺、倒置顯微鏡、酶聯(lián)免疫儀( Thermo Labsystems)、離心機(jī)、培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板、液氮罐等，冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康技術(shù)公司) 圖片 圖片 2、方法 2.1貓爪草皂苷及多糖提取物的制備 參考文獻(xiàn)方法[5，6]精密稱取干燥的貓爪草100g，粉碎成粗顆粒，置索氏提取器中，用95%乙醇提取6h，醇提液回收乙醇，用乙醚萃取2次，再以水飽和的正丁醇萃取3次，正丁醇萃取液用0.1mol/LNaoH萃取2次，正丁醇液回收至干，得總皂苷。醇提液殘?jiān)�，加水煎�?次，時(shí)間分別為2h、1h，合并水煎液，濃縮、離心去沉淀。上清液加入4倍95%乙醇，4℃冰箱中冷置24h，離心，收集沉淀。沉淀經(jīng)水復(fù)溶、脫蛋白、透析、冷凍干燥得總多糖。將所得皂苷和多糖用蒸餾水溶解，定容至1g生藥/mL，G6漏斗濾過除菌，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br /> 2.2 MTT法測定細(xì)胞增殖的抑制率[7] 采用RPMI-1640培養(yǎng)液，含青霉素10萬U/L、鏈霉素10萬U/L、10%新生小牛血清(FCS，56℃滅活30min)緩沖液調(diào)pH至約7.2，將待測細(xì)胞株配成單個(gè)細(xì)胞懸液。取對數(shù)生長期細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化后，用培養(yǎng)液稀釋至濃度4~5×104/mL，接種于96孔板，每孔加入190μL。同時(shí)設(shè)溶劑對照，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)平行孔，常規(guī)培養(yǎng)24h后，加入不同劑量的受試藥物，在37℃飽和濕度、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，后，每孔加入MTT溶液(用生理鹽水配制)10μL(5mg/mL)，震蕩混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸去上清，每孔加入150μL二甲基亞砜，輕輕振蕩，約1h后，用酶標(biāo)儀在570nm波長處測其OD值，計(jì)算抑制率，求IC50，測定時(shí)減去空白對照。按下列公式計(jì)算細(xì)胞毒性：細(xì)胞毒性=(1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值)x100%。 2.3集落形成實(shí)驗(yàn)[8] 將待測細(xì)胞株以100個(gè)細(xì)胞/皿分別接種于10mL37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)24h后，加入受試藥物，在37℃飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d，棄去培養(yǎng)液，用PBS(0. 01mol/L，pH至約7.4)小心浸洗3遍，10%甲醇固定，15min后棄去固定液，0.25%龍膽紫染色。顯微鏡計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，對照組以培養(yǎng)液代替受試藥物，結(jié)果以克隆形成率(%)表示(克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%)。 3、結(jié)果與分析 3.1貓爪草皂苷及多糖提取物不同劑量對S180、EAC、MCF-7不同腫瘤細(xì)胞株的殺傷作用，見表1。 表1結(jié)果顯示，三個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量組的貓爪草皂苷和多糖對肉瘤S18o、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的生長均有不同程度的抑制作用，各劑量組與陰性對照組比較均有顯著性的差異。貓爪草皂苷給藥量與抑瘤率明顯地呈正相關(guān)關(guān)系，而多糖在給藥量0.10mg/mL時(shí)，抑瘤效果最好，過高或過低都會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從直觀分析可以看出，皂苷比多糖抑瘤效果好。 3.2貓爪草皂苷及多糖提取物不同劑量對S180、EAC 、MCF-7不同腫瘤細(xì)胞株集落形成的影響，見表2。 表2結(jié)果顯示，貓爪草皂苷三個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量組對三種腫瘤細(xì)胞株的集落形成均有不同程度的影響，各劑量組與陰性對照組比較均有顯著性的差異。而多糖在給藥劑量0.10-10.20mg/mL，時(shí)影響明顯，劑量過低幾無影響。 4、討論 貓爪草在臨床上具有確切的抗腫瘤效果，有關(guān)其抗腫瘤的機(jī)制，曾有人從微量元素與健康的角度認(rèn)為，癌癥患者血清中Cu/Zn值升高，而貓爪草Cu/Zn值趨向與癌癥患者Cu/Zn相反，因此可能有助于調(diào)節(jié)患者體內(nèi)Cu、Zn平衡而發(fā)揮抗癌效果[9]；另有研究認(rèn)為，貓爪草70%的乙醇浸膏對瘤壞死因子(TNF)具有較強(qiáng)的誘生作用[10]，其他尚未見有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)化學(xué)成分預(yù)試的結(jié)果，對其含量較高的兩種主要提取物進(jìn)行了體外抗腫瘤作用的初步研究。結(jié)果顯示，貓爪草皂苷及多糖對肉瘤S180、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的三種腫瘤細(xì)胞株的生長和集落形成均有不同程度的影響，與陰性對照組比較有顯著性的差異；皂苷比多糖抑瘤效果好，皂苷給藥劑量與抑瘤率和集落形成明顯地呈正相關(guān)關(guān)系，而多糖有一最佳劑量。本研究不僅為尋找貓爪草抗腫瘤的有效部位奠定了基礎(chǔ)，也為貓爪草治療腫瘤的機(jī)理提供了理論依據(jù)。  皂苷和多糖是廣泛存在于植物界的兩大類復(fù)雜的化合物，其分離分析一直是比較活躍的研究領(lǐng)域。諸多研究表明，皂苷類有效成分在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、護(hù)心、護(hù)腦、延緩衰老及對心腦血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、造血系統(tǒng)等方面發(fā)揮了越來越重要的作用[11]；而多糖作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑，生物學(xué)特性更廣泛，如抗腫瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗放射、降血糖、降血脂等[12]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)貓爪草皂苷及多糖體外均有抗腫瘤作用，而其抗腫瘤確切的有效成分及結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系還有待深入探討，我們正在進(jìn)一步研究中。 【藥品名稱】貓爪草膠囊 【成份】貓爪草。 【性狀】本品為膠囊劑，內(nèi)容物為棕褐色光滑小丸粒；氣微，味微酸。 【功能主治】散結(jié)，消腫。用于瘰疬，淋巴結(jié)核未潰者，亦可用于肺結(jié)核。 【規(guī)格】每粒裝0.53g。 【用法用量】口服，一次4-6粒，一日3次，黃酒送服。連服六日，隔三日后再服。老人及兒童酌減。（兒童用快接健沖溫開水送服，3至4歲一次1粒，5至8歲一次2粒，9至12歲一次3粒，每日3次；女士避開經(jīng)期。） 【不良反應(yīng)】尚不明確。 【禁忌】尚不明確。 【貓爪草適應(yīng)癥】乳腺增生，子宮肌瘤，前列腺炎、增生、肥大，甲狀腺結(jié)節(jié)，囊腫，淋巴結(jié)腫大，腫瘤，結(jié)核，宮頸糜爛，糖尿病，痛風(fēng)，頑固性牙痛，偏頭痛，肝病等。 參考文獻(xiàn) 1、中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典，一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.260. 2、金山叢.中藥貓爪草的研究概況.中藥材，1993，16(11)：36-38. 3、周維順，吳良村.惡性淋巴瘤證治述要.浙江中醫(yī)雜志，1997，32(8)：345. 4、楊今祥.抗癌中草藥制劑.北京：人民衛(wèi)生出版社，1981.173. 5、周躍華，徐德生，馮怡，等.麥冬總皂苷提取工藝的研究.中草藥，2002，23(12)：1076-1078. 6、中國科學(xué)院上海藥物研究所.中草藥有效成分提取與分離第二版.上海：上�？茖W(xué)技術(shù)出版社，1983. 7、Twentyman PR. 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