金銀花中綠原酸含量測(cè)定和指紋圖譜研究進(jìn)展 | 金銀花中綠原酸含量測(cè)定和指紋圖譜研究進(jìn)展 |
| 發(fā)布時(shí)間:2011-09-03 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):2835 |
摘 要:通過(guò)對(duì)近幾年來(lái)金銀花中主要有效成分綠原酸的含量測(cè)定方法和藥材的指紋圖譜進(jìn)行綜述,為今后的深入研究提供參考。 關(guān)鍵詞:金銀花 綠原酸 指紋圖譜 金銀花提取物綠原酸 金銀花為忍冬科植物忍冬紅腺忍冬山銀花或毛花柱忍冬的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。 該藥為中醫(yī)常用藥，綠原酸為金銀花的主要功 能性成分，其藥效高低取決于綠原酸的含量。 綠原酸為咖啡�？崴嵫苌�，易溶于乙醇、 丙酮，微溶于乙酸乙酯，是一種重要的生理活性物質(zhì)，它具有抗菌、抗病毒、解熱、升高 白細(xì)胞、保肝利膽、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基等作用。筆 者在本文中綜述了金銀花藥材的指紋圖譜研究進(jìn)展及其主要有效成分綠原酸的含量測(cè)定 方法，為今后的深入研究提供參考。 1含量測(cè)定方法 除中國(guó)藥典規(guī)定的檢測(cè)方法外，已見(jiàn)報(bào)道的分析方法有紫外分光光度法、導(dǎo)數(shù)光譜 法、薄層層析法、阻抑一催化褪色光度法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、高效液相色譜法(HPLC 法)等。 1．1紫外分光光度法 李娜等“1研究建立了金銀花提取液中綠原酸含量的UV快速測(cè)定方法，經(jīng)HPLC檢驗(yàn)， 該方法準(zhǔn)確、快速、方便，紫外光譜中和綠原酸含量相關(guān)性最佳的波長(zhǎng)點(diǎn)為294 nm，綠原酸含量測(cè)定值和預(yù)測(cè)值之間具有良好的相 關(guān)性(r=0．995 2，n=l1)，此方法可用于清開(kāi)靈注射液生產(chǎn)過(guò)程中金銀花提取液的在線 質(zhì)量控制；由于綠原酸分子中含有酚羥基，張秋芳等 1根據(jù)酚類物質(zhì)中酚羥基與三氯化鐵的顯色反應(yīng)，發(fā)覺(jué)綠原酸與FeC 1，的顯色反應(yīng)產(chǎn)物的光密度與綠原酸的含量呈良好的線性關(guān) 系，因此建立了綠原酸含量的UV快速測(cè)定方法，此方法所得綠原酸含量皆高于HPLC法， 但其差異皆< 1O％ ，這可能是由于金銀花中還 會(huì)有少量其他物質(zhì)也會(huì)與顯色劑發(fā)生了顯色反應(yīng)，這提示在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)不同產(chǎn)地 金銀花的成分及其含量高低等對(duì)此快速測(cè)定法的實(shí)測(cè)結(jié)果進(jìn)行必要校正。 1．2 差示導(dǎo)數(shù)光譜法 林黎明I31發(fā)現(xiàn)以鎢酸鈉為分析試劑，能快 速與總綠原酸反應(yīng)生成復(fù)合物，根據(jù)其光譜的 特征性變化，采用差示導(dǎo)數(shù)分光光度法可不經(jīng)分離直接測(cè)定金銀花及其制劑銀翹解毒片中 的總綠原酸的含量．其平均回收率為100．4％，變異系數(shù)為1．82％。方法簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確。 1．3導(dǎo)數(shù)極譜法 李白林研究了綠原酸在檸檬酸介質(zhì)中 的電化學(xué)行為和綠原酸含量的線性掃描二階導(dǎo)數(shù)極譜法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在NH 一NH Cl介質(zhì)中，綠原酸不穩(wěn)定，易分解，導(dǎo)致較大的分析誤 差。而在檸檬三依中文酸鈉介質(zhì)中，對(duì)金銀花浸取液和銀黃注射液進(jìn)行綠原酸含量的測(cè)定，獲得令 人滿意的結(jié)果。 1．4薄層色譜掃描法 徐強(qiáng)等以薄層掃描法測(cè)定咽爽袋泡劑中 金銀花中的綠原酸的含量，用薄層掃描儀進(jìn)行 光譜掃描后，確定以三氯甲烷一醋酸乙酯一甲酸(2：2：1)為展開(kāi)劑，雙波長(zhǎng)反射法鋸齒掃描， = 325nm， =327nm，S 3，此方法簡(jiǎn)便，測(cè)定準(zhǔn)確；魏云等 l也采用了薄層掃描法對(duì) 金銀花中綠原酸進(jìn)行了測(cè)定，樣品提取條件經(jīng) 試驗(yàn)表明，甲醇、7O％乙醇使斑點(diǎn)容易擴(kuò)散， 使用乙醇提取效果較好，薄層條件經(jīng)比較，選 用氯仿一醋酸乙酯一甲酸(4：4：2)為展開(kāi)劑能達(dá)到較好的分離效果，鋸齒形反射法雙波長(zhǎng)掃 描， 325nm， R4OOnm，掃描速度20ram ／ rain，狹縫1．25ram ×1．25ram，記錄儀靈敏度 ×2，線性參數(shù)×3；李宗等”1用聚酰胺薄膜分離綠原酸，用薄層掃描法測(cè)定其含量，為金銀 花及其制劑海菊沖劑的質(zhì)量控制提供了一個(gè)新的方法。利用聚酰胺薄膜對(duì)綠原酸進(jìn)行分 離和定量，色譜峰形好，消除了綠原酸在硅膠 薄層上的拖尾現(xiàn)象。 1．5阻抑一催化褪色光度法 在鹽酸介質(zhì)中，鐵(Ⅲ)能靈敏地催化過(guò)氧 化氫還原亮綠sF的反應(yīng)，綠原酸對(duì)催化反應(yīng)有 靈敏的阻抑作用，耿玉珍等 1據(jù)此建立了測(cè)定 痕量綠原酸的阻抑一催化動(dòng)力學(xué)光度分析方 法。該方法測(cè)定綠原酸的線性范圍為0—0． 12mg／L；檢出限為4．2×l0 g／L。對(duì) 濃度為0．08 mg／L綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液6次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3．8％；回收率為 93．4％～1O5％，同時(shí)考察了反應(yīng)的最佳條 件和動(dòng)力學(xué)參數(shù)，探討了反應(yīng)機(jī)理，該方法用于測(cè)量金銀花浸取液中綠原酸的含量，取得了 較為滿意的結(jié)果。 1．6 毛細(xì)管區(qū)帶電泳法 毛細(xì)管電冰分析具有分辨率高、分析速度快及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已成為中藥質(zhì) 量研究中的一種廣泛、有效的分析技術(shù)。顏流水等 采用微波輔助萃取金銀花中的有效成分，用熔融石英毛細(xì)管柱(64．5cm ×50 m，有效長(zhǎng)度56cm)作為分離通道；以30mmol· L 硼砂(pH=9．3)為運(yùn)行緩沖溶液；分離電壓 20RV；毛細(xì)管柱溫25℃ ；檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm(綠原酸)和270nm(蘆丁、槲皮素)同時(shí)分離和測(cè) 定金銀花中蘆丁、綠原酸和槲皮素的含量， 為全面有效控制金銀花藥材質(zhì)量提供一種簡(jiǎn)便、快速方法；龍虹I1。 等提出了一種測(cè)定金銀 花和含金銀花的八種中成藥中綠原酸標(biāo)志物 的毛細(xì)管區(qū)帶電泳分析方法。所用的背景電解質(zhì)為含有l(wèi)Ommol／L磷酸鹽和20retool／ L硼酸鹽的pH7．00的緩沖溶液，并含有5％的 乙醇以提高樣品的溶解度。測(cè)定的線性范圍在27．765～665ug／mL，相關(guān)系數(shù)r 0． 9996。測(cè)定金銀花和含金銀花的8種中成藥 中的綠原酸可以在15rain內(nèi)完成。這種分析 方法簡(jiǎn)單、快速、適用面廣。 1．7高效液相色譜法 目前測(cè)定金銀花中綠原酸含量的主要方 法還是高效液相色譜法。劉明斌等⋯ 用流動(dòng) 相：乙腈一0．1％ 磷酸(20：8O，v／v)；流速：0． 8 ml／min，檢測(cè)波長(zhǎng)：327nm，進(jìn)樣量：1O l； 柱溫：室溫，在ODS柱上比較三種不同產(chǎn)地的 金銀花中綠原酸的含量，并鑒別出含綠原酸含 量較高的品種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隆回縣金銀花綠原酸含量較高，河南密縣金銀花綠原酸含量較低， 山東臨沂地區(qū)平邑縣金銀花綠原酸含量更低； 劉恩荔等I1 l采用HypersilODS2色譜柱，以乙 腈：水：冰醋酸(15：85：0．2)為流動(dòng)相，流速0． 8 ml／min，檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm，柱溫25℃建立 測(cè)定金銀花有效部位中綠原酸含量的高效液 相色譜法，作者比較了不同比例的冰醋酸，結(jié)果表明，當(dāng)冰醋酸的濃度為0．2％時(shí)，可得到較好的色譜峰峰形；王天志等I1 1建立了用反相高 效液相色譜內(nèi)標(biāo)法梯度洗脫，同時(shí)測(cè)定金銀花中綠原酸、咖啡酸、3，5一二咖啡�？崴� 含量的方法，并對(duì)4個(gè)產(chǎn)地3種金銀花中上述 3種化合物進(jìn)行定暈分析。方法：采用島津 CLC— ODS柱(6．0ram ×150ram)，甲醇一1O ％的磷酸氫二鈉和醋酸緩沖液流動(dòng)相不同比 例進(jìn)行梯度洗脫，內(nèi)標(biāo)物為水楊酸，檢測(cè)波長(zhǎng) 304nm。結(jié)果發(fā)現(xiàn)西南地區(qū)金銀花藥材主流 商品灰氈毛忍冬、細(xì)氈毛忍冬干燥花蕾中綠原酸、咖啡酸、3，5一二咖啡酰奎尼酸含量 高于山東、河南產(chǎn)金銀花。本法靈敏快速， 準(zhǔn)確可靠。 2金銀花指紋圖譜 中藥指紋圖譜為在給定的色譜條件下，藥材中各組分的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為 各組分所特有，如同人的指紋，利用相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積建立樣品的相對(duì)保留值指 紋譜．通過(guò)對(duì)樣品色譜的數(shù)據(jù)化可產(chǎn)生一系列的參數(shù)，包括n強(qiáng)峰、特征峰群及特征指紋 峰檢出率等，為鑒定和區(qū)分中藥材的品質(zhì)提供客觀依據(jù)。目前金銀花的指紋圖譜研究有 GC法，HPLC法，HPCE法等。 2．1 GC法 田吉等” 1采用島津G C一1 4B；CR 一 7Aplus數(shù)據(jù)處理器；SE一30石英毛細(xì)管柱 (25m ×0．22mm)；柱溫90~C初溫，以4℃／min 升至200~C，40~C／min升至240~C保持；載氣： 高純氮?dú)?．2ml／min；補(bǔ)充氣：氮?dú)?0ml／ min，分流比1：10；氫氣40 ml／min；空氣500 ml／min；檢測(cè)器FID；檢測(cè)室245℃ ；氣化室 235℃，建立了金銀花藥材的氣相色譜指紋圖 譜。該法以芳樟醇為參照物，對(duì)11批金銀花進(jìn) 行分析，發(fā)現(xiàn)其中24個(gè)峰為各批次共有的特 征峰，選擇為共有指紋峰。得到金銀花藥材的 氣相指紋圖譜。芳樟醇色譜峰分離度好．強(qiáng)度高，故選為參照物峰。以芳樟醇峰的保留時(shí)間 及峰面積為1，計(jì)算其他各共有指紋峰的相對(duì) 保留時(shí)間和峰面積比值，并對(duì)占總峰面積10％ 以上的峰計(jì)算峰面積比值差值，得到金銀花氣相指紋圖譜技術(shù)參數(shù)。結(jié)果表明金銀花氣相 指紋圖譜穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好、特征性強(qiáng)、峰面積比值及其差值、非共有峰面積均符合規(guī)定， 結(jié)果穩(wěn)定可靠，可作為注射用金銀花藥材的鑒別標(biāo)準(zhǔn)之一。王斌等” 應(yīng)用GC色譜法建立了中藥金銀花的指紋圖譜，并對(duì)相似度計(jì)算軟件 應(yīng)用過(guò)程中某些問(wèn)題進(jìn)行了探討。方法：使用SGE 30QC3石英毛細(xì)管柱(30m ×0．32ram ×0．5“1TI)；柱溫：初溫100~C，以2℃ ／min 升至1 50℃ ，5℃ ／1TIin升至1 70℃保持 40rain；載氣：高純氮?dú)�，流量�?．0ml／min；尾 吹氣：氮?dú)猓?0 ml／min，分流比1：10；氫氣，40 ml／min；空氣，400 ml／min；檢測(cè)器：FID； 檢測(cè)器溫度：200~C；氣化室溫度：200~C。從此 方法建立了藥材GC指紋圖譜共有模式，并對(duì) 不同批藥材進(jìn)行了相似度比較，藥材各成分得 到了很好的分離，可作為該藥材的指紋圖譜。 2．2 HPCE法 容蓉等I 以40 mmoL／L硼砂溶液為緩沖液，利用高效毛細(xì)管電泳法，建立不同產(chǎn)地 金銀花的HPCE指紋圖譜。石英毛細(xì)管：57 cm x 75 m(有效長(zhǎng)度50 cm)，工作電壓為 17 kV，溫度為25℃，壓力進(jìn)樣時(shí)間為6 S，檢 測(cè)波長(zhǎng)：214 nm。通過(guò)對(duì)指紋圖譜特征峰數(shù) 據(jù)進(jìn)行聚類分析，將不同產(chǎn)地的藥材分為3 類，并對(duì)各類樣品建立判別函數(shù)。利用指紋 圖譜技術(shù)，通過(guò)聚類分析或建立判別函數(shù)，可以對(duì)不同產(chǎn)地的金銀花藥材進(jìn)行判別和質(zhì)量 控制；孫國(guó)祥等11 7I采用毛細(xì)管區(qū)帶電冰法，以 50 mmol／L硼砂(含20 mmol／L一環(huán)糊精，用磷酸調(diào)pH 8．0)為背景電解質(zhì)，運(yùn)行電壓12 kV，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，重力進(jìn)樣 l5 s(高度8．5 cm)，建立了金銀花藥材水提 取液的毛細(xì)管電泳指紋圖譜。將l3個(gè)不同產(chǎn) 地的金銀花藥材供試液的毛細(xì)管電泳指紋圖譜進(jìn)行比較，以電泳峰出現(xiàn)率100％ 計(jì)，確定 金銀花的共有指紋峰為l 8個(gè)，該方法具有較 好的精密度和重現(xiàn)性，分離效能高且成本低廉。 2．3 HPLC法 白雪梅等I 1采用HPL C法建立金銀花的 指紋圖譜。色譜條件為：色譜柱YGW —C18 (2 50mm x 4．6mm ，1 0 m)，檢測(cè)波長(zhǎng) 238nm，柱溫30℃，流動(dòng)相：A液一0．4％磷酸 水溶液，B液一乙腈，進(jìn)樣量為20 l，進(jìn)行梯 度洗脫，所有組分在40min內(nèi)出峰，并對(duì)4個(gè) 產(chǎn)地金銀花中所含的組分進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)并測(cè)定其綠原酸含量，。結(jié)果為4個(gè)產(chǎn)地金銀花指 紋譜主要特征大致相同，金銀花主要成分之一綠原酸含量與對(duì)照藥材相比無(wú)顯著性差異(p >0．05)；陽(yáng)利龍以綠原酸為參照物，對(duì)產(chǎn)于 山東2003—2004年不同采集時(shí)間的10批忍冬 金銀花進(jìn)行甲醇提取物HPLC指紋圖譜方法 的建立。色譜柱為ODS，(4．6mm ×250mm， 5 1TI)，流動(dòng)相：乙腈：0．4％磷酸(1 5：85)，柱溫：3 0℃ ，流速：1 1TIl／1TIi n，檢測(cè)波長(zhǎng)： 307nm。結(jié)果為藥材有15個(gè)共有峰，其參數(shù)符 合”中藥注射劑指紋圖譜技術(shù)要求“的有關(guān)規(guī) 定，可以作為金銀花質(zhì)量評(píng)價(jià)和品種鑒剮的重要依據(jù)之一；王倩等 【l】用梯度洗脫法，對(duì)金銀花 藥材進(jìn)行H P L C 測(cè)定。條件為：色譜柱 Z0RBAX SB— C18(150mm ×4．6mm，5 m)；流動(dòng)相：A相為1％ 醋酸水溶液，B相為甲 醇進(jìn)行梯度洗脫；流速：1．0 mL／ml；檢測(cè)波長(zhǎng)：254rim；柱溫：30℃ 。運(yùn)用梯度洗脫能 很好分離金銀花的各類成分，經(jīng)方法學(xué)考察， HPLC指紋圖譜具有良好的重現(xiàn)性，l0批樣品 中1 1個(gè)特征指紋峰有專屬性，此研究建立的 金銀花藥材HPLC指紋圖譜分析法可用于金 銀花藥材質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)。 |
