杜仲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸的初步研究 | 杜仲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸的初步研究 |
| 發(fā)布時(shí)間:2011-09-18 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):2450 |
隨著生物技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用植物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵生 產(chǎn)藥用物質(zhì)正發(fā)展成為一門新型的產(chǎn)業(yè)體系。在植 物細(xì)胞培養(yǎng)中，影響細(xì)胞生長和次生代謝物形成的因 子如植物激素、氣體成分、光照和培養(yǎng)基成分等在水 母雪蓮、三七、人參和紅豆杉中多有研究(孑L祥海， 2005；唐建軍等，1998)，但在藥用植物杜仲中很少報(bào) 道。杜仲(Eucommia ulmoides)是重要的中藥材，其 藥用成分包括綠原酸、桃葉珊瑚甙、總黃酮等。其中， 綠原酸(Chlorogenic acid，以下簡稱Cha)是一種重要 的生物活性物質(zhì)，具抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中 樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用，它是許多中藥材的有效成分之 一 ，又是某些成藥的質(zhì)量指標(biāo)。其應(yīng)用非常廣泛，主 要為醫(yī)藥、日用化工和食品行業(yè)。綠原酸主要存在于 杜仲葉、皮中，含量較低，提取量有限，并存在農(nóng)藥殘 留和重金屬殘留等問題，因此，目前多采用組織培養(yǎng) 技術(shù)，在組織和細(xì)胞水平上促進(jìn)綠原酸的生物合成。 本文對(duì)影響杜仲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及其次生代謝物綠原 酸形成的幾種主要因子如碳源、培養(yǎng)基、pH、激素等 進(jìn)行研究，初步得出生產(chǎn)綠原酸的優(yōu)化條件，為通過細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)次生代謝物綠原酸奠定了基礎(chǔ)。 1 材料和方法 1．1實(shí)驗(yàn)材料 供試材料為采自廣東樂昌縣杜仲基地的種子。 1．2愈傷組織的誘導(dǎo) 杜仲愈傷組織由杜仲種子萌發(fā)的無菌苗真葉誘 導(dǎo)。誘導(dǎo)的愈傷組織接種于含有2O mL B5(附加 0．5 mg／L 2，4一D、0．5 mg／L 6-BA和20 g／L蔗糖) 固體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中。置于GXZ型智能 光照培養(yǎng)箱中(25±2℃)培養(yǎng)，光照10 h／d、黑暗 14 h／d，光照強(qiáng)度72／~mol·m�！- 。愈傷組織每 15～2O d繼代1次，經(jīng)過半年的馴化培養(yǎng)得到無性 細(xì)胞系。 1．3細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立 將生長旺盛、結(jié)構(gòu)疏松、易于分散的愈傷組織轉(zhuǎn) 移到液體培養(yǎng)基中，置于搖床中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，搖床 轉(zhuǎn)速為110 r／rain，培養(yǎng)溫度25±2℃ ，全天光照，光 照強(qiáng)度72 mo1．m-�！～。培養(yǎng)2～3周后，培養(yǎng)液 中即有懸浮單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)。繼代培養(yǎng)時(shí)， 加入等量的新鮮培養(yǎng)液，搖勻，稍靜置，待大細(xì)胞團(tuán) 沉降后分瓶，不需過濾，即可得到不含大細(xì)胞團(tuán)塊的 培養(yǎng)物。這樣通過3～4次繼代培養(yǎng)，即可得到只含 單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)的培養(yǎng)物。 1．4懸浮細(xì)胞生長的測(cè)定 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾，蒸餾水洗滌3次， 抽濾去表面水分，稱量鮮樣質(zhì)量Fw(g／L)，50℃烘 干后稱量干樣質(zhì)量DW(g／L)。細(xì)胞增長率一(收 獲細(xì)胞量一接種細(xì)胞量)／接種細(xì)胞量×100 。 1．5懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中綠原酸含量的HPLC法測(cè)定 參考楊小梅等(2003)的方法。樣品準(zhǔn)備：將收集 的杜仲于細(xì)胞置于i00“1L錐形瓶中，加人5O 9／6甲醇 40 mL，密封后稱量，超聲處理6O min，放至室溫，用 5O 甲醇補(bǔ)充至4O mL，搖勻，過濾，取濾液用0．22 m 微孔濾膜過濾，濾液供HPI￡分析用。HPLC條件：流 動(dòng)相乙腈：0．1 磷酸=15：85，流速l1 0 mL／min，柱 溫25℃ ，進(jìn)樣體積2O L，檢測(cè)波長327 rlin，色譜柱 XDB-CI8 Analytical 4．6×250 mm 5—1V~cron。 2 結(jié)果與分析 2．1杜仲懸浮細(xì)胞生長曲線與綠原酸含量的變化 在相同的培養(yǎng)條件下，分別于第3～21天每3 d隨機(jī)抽取6瓶培養(yǎng)物，測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的干重和其中 綠原酸的含量，結(jié)果見圖1。由圖1可知，杜仲懸浮 培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線基本為S型，經(jīng)歷了4個(gè)階段：遲 滯期、快速生長期、生長平衡期和衰亡期。在培養(yǎng)前 期，綠原酸的含量隨細(xì)胞增長而逐漸增加，第15天 時(shí)達(dá)到最大含量�；诒狙芯磕康氖菫榱双@得高產(chǎn) 量的次生代謝物綠原酸，因此，宜選取生長到第l5 天時(shí)的細(xì)胞作為種子液。 2．2碳源對(duì)杜仲懸浮細(xì)胞生長和綠原酸含量的影響 2．2．1不同碳源對(duì)杜仲懸浮細(xì)胞生長和綠原酸含量 的影響 糖類是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵 之一，糖的種類和用量不僅影響培養(yǎng)物生長速度和 生長量，而且影響其代謝水平和次生代謝物的合成 (韓建萍等，2003)。本實(shí)驗(yàn)比較了蔗糖、葡萄糖、麥 芽糖等不同碳源對(duì)杜仲懸浮細(xì)胞生長和綠原酸含量 的影響，其中不同碳源的濃度為20 g／L。由圖2可 知，無論是細(xì)胞生長還是綠原酸的積累，蔗糖作為碳 源最為合適。 3 討論 影響懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中次生代謝物含量的因素 很多，如外植體種性、生育狀態(tài)、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)條件 等內(nèi)外因素。內(nèi)在因素主要指物種的特性，外界因素 主要是培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基類型、碳源、pH、激素等，這 些均能顯著影響細(xì)胞培養(yǎng)過程中次生代謝物的累積。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明杜仲細(xì)胞生長量最大的培養(yǎng)基配方 其綠原酸的積累量不一定最大，N6培養(yǎng)基更利于細(xì) 胞生長，而MS培養(yǎng)基更有利于綠原酸的合成。由此 可見，適合細(xì)胞生長的培養(yǎng)基不一定利于次生代謝物 的累積，這與吳曉玲等(2005)、曹孟德等(2002)對(duì)黃 芩、香莢蘭細(xì)胞培養(yǎng)的研究結(jié)果一致。就杜仲細(xì)胞培 養(yǎng)而言，應(yīng)采用兩步培養(yǎng)法，前期細(xì)胞增殖用N6培 養(yǎng)基，綠原酸積累應(yīng)采用MS培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基的pH值作為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的重要因素 對(duì)細(xì)胞生長及次生代謝物的合成起重要作用，這是 因?yàn)榕囵B(yǎng)基的酸堿度對(duì)培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)成分(如 Fe鹽中的鐵離子等)的活性有直接影響，進(jìn)而影響 細(xì)胞對(duì)其的吸收利用。實(shí)驗(yàn)表明，pH值對(duì)綠原酸的合成影響較大，當(dāng)pH值為5．3時(shí)，綠原酸的含量 最大。 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長曲線大多為S 形(阮茜等，1999)，各時(shí)期乃至整個(gè)生長周期的長短受 到植物種類、起始細(xì)胞密度、營養(yǎng)成分種類與配比等多種因素影響。吳曉玲等(2005)報(bào)道黃芩的細(xì)胞培養(yǎng)周 期為9 d，而紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)周期從12～18 d不等 (Fett-Neto等，1994；Wickremesinhe& Arteca，1994； Gibson等，1993)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，杜仲懸浮培養(yǎng)細(xì) 胞生長曲線基本為S型，經(jīng)歷了4個(gè)階段：遲滯期、快 速生長期、生長平衡期和衰亡期。在培養(yǎng)前期，綠原 酸含量基本隨細(xì)胞增長而逐漸增加，第15天時(shí)達(dá)最 大含量，即培養(yǎng)周期為15 d。與同是喬木的藥用植物 紅豆杉結(jié)果相近，適合大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謂 物綠原酸。 外源激素常作為誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的重要因 素而用于次生代謝產(chǎn)物的研究，其中生長素和細(xì)胞分 裂素的作用大不相同。一定濃度的外源激素可明顯 促進(jìn)細(xì)胞生長，同時(shí)會(huì)抑制次生代謝物的產(chǎn)生，如 NAA促進(jìn)桔葉雞眼藤懸浮培養(yǎng)物中蒽醌的產(chǎn)生，而 2，4一D則完全抑制蒽醌的合成(楊世海等，2005)。本 實(shí)驗(yàn)比較了三種不同濃度的外源激素2，4一D、NAA 和6一BA對(duì)杜仲懸浮細(xì)胞生產(chǎn)綠原酸的影響，結(jié)果顯 示1．0 mg／L的6-BA促使綠原酸合成的效果最好。 |
