同厚樸酚制劑的制備、表征及其在SD大鼠體內(nèi)藥動學行為比較 | 同厚樸酚制劑的制備、表征及其在SD大鼠體內(nèi)藥動學行為比較 |
| 發(fā)布時間:2022-03-06 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):754 |
| 目的 制備厚樸酚固體分散體、磷脂復合物和固體脂質(zhì)納米粒，并分別比較其在SD大鼠體內(nèi)的藥動學行為。方法 溶劑揮發(fā)法制備厚樸酚固體分散體和磷脂復合物，采用X射線粉末衍射（X-RayPowder Diffraction，XRPD）技術(shù)分析厚樸酚的存在狀態(tài)。高壓均質(zhì)法制備厚樸酚固體脂質(zhì)納米粒，并測定其粒徑分布及Zeta電位。以厚樸酚原料藥為參考，分別比較固體分散體、磷脂復合物和固體脂質(zhì)納米粒的體外溶出情況。SD大鼠分別ig給予厚樸酚、固體分散體、磷脂復合物和固體脂質(zhì)納米�；鞈乙海琀PLC法測定厚樸酚血藥濃度，計算主要藥動學參數(shù)，并比較藥動學行為及相對生物利用度。結(jié)果 厚樸酚在固體分散體和磷脂復合物中均以無定型狀態(tài)存在。厚樸酚固體脂質(zhì)納米粒Zeta電位為（−29.16±1.83）mV，平均粒徑為（161.37±3.77）nm。厚樸酚原料藥在12 h內(nèi)的累積溶出度為30.6%，而厚樸酚固體分散體、固體脂質(zhì)納米粒和磷脂復合物將其12 h內(nèi)累積溶出度分別提高至96.3%、76.4%、45.9%。ig給藥后Cmax、AUC0～t和AUC0～∞等藥動學參數(shù)與原料藥相比均具有顯著提高。其中，磷脂復合物、固體分散體和固體脂質(zhì)納米粒將其Cmax由（429.67±53.12）ng/mL分別提高至（533.62±59.01）、（721.73±103.44）、（1 063.21±108.22）ng/mL。相對生物利用度分別提高至1.38、2.12、3.45倍。結(jié)論 3種制劑均可提高厚樸酚口服吸收生物利用度，但厚樸酚固體脂質(zhì)納米粒效果更為明顯。 厚樸是傳統(tǒng)中醫(yī)藥廣泛使用的一味中藥[1]，研究結(jié)果顯示[2-3]，其主要活性成分之一厚樸酚（magnolol，Mag）具有中樞神經(jīng)抑制、中樞性肌肉松弛、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、治療心肌損傷等多種藥理活性。但由于溶解度和脂溶性均較差，其生物利用度很低[4]。因此，改善厚樸酚溶解度，促進其體內(nèi)吸收，是擴大其臨床應(yīng)用首選需要解決的問題。目前已有厚樸酚脂質(zhì)體、膠束等制劑新技術(shù)的研究報道[4-5]。 磷脂復合物（phospholipids complex，PC）技術(shù)[6]是將難溶性藥物與磷脂或磷脂酰膽堿形成一種復合物后，藥物的水溶性及脂溶性可同時得以提高，可促進藥物吸收，提高生物利用度。固體分散體（solid dispersion，SD）[7]是將藥物分散于親水性高分子材料（PVK K30、泊洛沙姆188等）中，可增加藥物溶解度，促進藥物快速溶出進入血液循環(huán)，進而提高生物利用度。固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）[8]通過一定的制劑技術(shù)，將生理相容性較高的脂質(zhì)材料與藥物制備成粒徑在1～1 000 nm的膠粒給藥系統(tǒng)，增加藥物的溶解度及穩(wěn)定性，改變吸收途徑，提高生物利用度。雖然厚樸酚磷脂復合物和固體分散體已有研究報道[7]，但并未在同一條件下比較二者體內(nèi)藥動學及口服吸收生物利用度提高等情況。本研究首次成功制備了厚樸酚固體脂質(zhì)納米粒（Mag-SLN），并比較了Mag- SLN、厚樸酚磷脂復合物（Mag-PC）和厚樸酚固體分散體（Mag-SD）3種制劑在SD大鼠體內(nèi)的藥動學情況，為厚樸酚制劑學研究提供參考。 1 儀器與材料 1.1 儀器 FA2204T型電子天平，配備防風罩，Dor Yang公司；1200型HPLC色譜儀，安捷倫公司；CJ-78-1A型磁力攪拌器、DZF-6050型真空干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；D8 Advance型X粉末射線衍射儀，德國Bruker公司；110-L2型高壓均質(zhì)機，Mfic公司；DW-86L28型超低溫冰箱，捷勝公司；Nano ZS90型納米粒度儀，英國Malvern公司；R200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，BUCHI公司；HF5000型透射電子顯微鏡（TEMS），200 V，日立高新技術(shù)公司；LGJ18-D型冷凍干燥機、HP-15型氮氣吹掃儀，舜制儀器公司。 1.2 材料及動物 厚樸酚，批號M160515，質(zhì)量分數(shù)98.0%，旭煌生物科技有限公司；厚樸酚對照品，批號110729- 201508，質(zhì)量分數(shù)98.8%，中國食品藥品檢定研究院；大豆卵磷脂，批號190511，上海太偉藥業(yè)有限公司；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP K30），批號25000240379，Ashland公司；硬脂酸甘油酯，批號20150915，鄭州宇控生物科技有限公司；泊洛沙姆188，批號P21489，巴斯夫公司；聚山梨酯80（Tween-80），批號201806-4，上海博湖生物科技有限公司。SD大鼠，體質(zhì)量（300±20）g，購自河南省實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為20 ℃，濕度為45%，動物許可證號SCXK（豫）2016-0002。 2 方法與結(jié)果 2.1 厚樸酚含量測定 2.1.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；檢測波長293 nm；流動相為甲醇-水（66∶34）；體積流量1.0mL/min；進樣體積20 μL。在該色譜條件下，輔料不干擾樣品測定，厚樸酚的保留時間為7.50 min，色譜圖見圖1。 圖片 2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取厚樸酚12.20 mg，溶解于10 mL量瓶中。采用甲醇-水（76∶34）混合溶液逐步稀釋成0.122、0.560、1.220、3.050、6.100、12.200 μg/mL。分別進HPLC色譜儀，以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸后得回歸方程Y＝17.1283 X－2.8814，r＝0.999 9，結(jié)果表明厚樸酚在0.122～12.200 μg/mL線性關(guān)系良好。 2.1.3 供試品溶液的制備 取Mag-PC（約10 mg）、Mag-SD（約10 mg）和Mag-SLN（1.0 mL），置于25 mL量瓶中，加甲醇至20 mL后超聲5 min，采用甲醇定容至刻度線，混勻后5 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL置于25 mL量瓶中，流動相定容，即得供試品溶液。 2.1.4 精密度試驗 選擇質(zhì)量濃度為0.122、6.100、12.200 μg/mL的厚樸酚對照品溶液作為低、中、高質(zhì)量濃度，分別進HPLC色譜儀測定厚樸酚色譜峰面積。計算結(jié)果顯示，3種質(zhì)量濃度分別連續(xù)進樣6次，結(jié)果顯示日內(nèi)精密度RSD值分別為0.20%、0.16%、0.32%。3種質(zhì)量濃度分別每天進樣1次，連續(xù)6 d，結(jié)果顯示日間精密度RSD值分別為0.55%、0.78%、0.61%，精密度較高。 2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下的Mag-PC、Mag-SD和Mag-SLN的供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、12、24、48 h進HPLC色譜儀測定峰面積，計算得3個樣品溶液在7個時間點峰面積RSD值分別為0.59%、0.66%、0.81%，樣品穩(wěn)定性較好。 2.1.6 重復性試驗 分別平行配制Mag-PC、Mag-SD和Mag-SLN 3個樣品供試品溶液，各6份，分別進HPLC色譜儀測定厚樸酚含量。結(jié)果顯示3個樣品中厚樸酚質(zhì)量分數(shù)的RSD值分別為1.14%、1.74%、1.33%，說明重復性良好。 2.1.7 加樣回收率試驗 分別取Mag-PC 11.26 mg、Mag-SD 10.84 mg和Mag-SLN 1.0 mL置于25 mL量瓶中，分別按照制劑中厚樸酚含有量的50%、100%、150%，加入厚樸酚對照品，加甲醇至20mL后超聲5 min，采用甲醇定容至刻度線，混勻后5 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL置于25 mL量瓶中，流動相定容，測定厚樸酚總含量，計算回收率。結(jié)果顯示3個樣品平均加樣回收率分別為99.11%、98.54%、99.74%，RSD分別為1.49%、1.73%、1.64%。該色譜條件可以用于厚樸酚含量測定。 2.2 Mag-PC的制備及晶型分析 稱取0.27 g厚樸酚和0.8 g大豆卵磷脂置100 mL四氫呋喃溶劑中，立即封口。于溫度為50 ℃，轉(zhuǎn)速為800 r/min，攪拌反應(yīng)3.0 h后得澄清溶液。同溫度條件下，將澄清溶液采用減壓旋蒸除去四氫呋喃，收集殘留物，即得Mag-PC。厚樸酚與大豆磷脂的物理混合物按同比例混合，即得。 晶型分析條件：Cu-Kα靶，掃描速度8°/min，電壓為40 kV，2θ為3°～45°。分別取適量的厚樸酚、大豆卵磷脂、物理混合物和Mag-PC置于玻璃板凹槽內(nèi)，進行掃描，圖譜見圖2。厚樸酚原料藥和物理混合物中出現(xiàn)大量晶型峰，大豆卵磷脂僅在3°～9°出現(xiàn)少量晶型峰。但將厚樸酚與大豆卵磷脂制備成Mag-PC后，厚樸酚和大豆卵磷脂的晶型峰均消失，說明厚樸酚的存在狀態(tài)發(fā)生了改變。 圖片 2.3 Mag-SD的制備及晶型分析 分別稱取0.27 g厚樸酚和1.35 g的PVP K30置于80 mL無水乙醇中。于溫度為50 ℃，轉(zhuǎn)速為800 r/min，攪拌反應(yīng)5.0 h后得澄清溶液。同溫度條件下，將澄清溶液采用減壓旋蒸除去無水乙醇，收集殘留物，即得Mag-SD。厚樸酚與PVP K30的物理混合物按同比例簡單混合，即得。 晶型分析的掃描條件同“2.2”項下。分別取適量的厚樸酚、PVPK30、物理混合物和Mag-SD置于玻璃板凹槽內(nèi)，用載玻片將樣品平面與玻璃面刮齊平后進行掃描，圖譜見圖3。厚樸酚原料藥和物理混合物中同樣出現(xiàn)大量晶型峰，但將厚樸酚與PVPK30制備成Mag-SD后，厚樸酚的晶型峰全部消失，說明厚樸酚在Mag-SD中的存在狀態(tài)發(fā)生了改變。 圖片 2.4 Mag-SLN的制備 取單硬脂酸甘油酯240 mg，大豆卵磷脂60 mg和厚樸酚30 mg置于15 mL乙醇，加熱至（75±2）℃溶解后即得有機相。取200 mg泊洛沙姆188置于溫度為（75±2）℃、體積為20 mL的蒸餾水中即得水相。攪速為1000 r/min，將有機相緩慢滴入水相中，繼續(xù)攪拌4 h，并濃縮至10 mL后即得初乳。將初乳進行超聲15 min（800 W，工作3 s間隔1 s），迅速置于冰箱進行固化20 min（溫度為4 ℃），即得Mag-SLN。參考文獻方法[8]測定其包封率為78.34%，載藥量為6.16%。 2.5 Mag-SLN的表征 2.5.1 粒徑分布及Zeta電位 取3批Mag-SLN混懸液，采用蒸餾水按照1∶15進行稀釋，測得平均粒徑為（161.37±3.77）nm，PDI為0.108±0.022（圖4），測得平均Zeta電位為（−29.16±1.83）mV（圖5）。 圖片 2.5.2 外貌觀察 取Mag-SLN混懸液，滴加在附有支持膜的銅網(wǎng)上，用濾紙吸干多余液體。靜置晾干后置于透射電鏡下并拍照，結(jié)果見圖6。制備的Mag-SLN為近似球形或橢球形，粒子之間無黏連。 圖片 2.6 Mag-SLN凍干粉的制備 采用乳糖作為凍干保護劑。取Mag-SLN混懸液5 mL置于西林瓶中，加入10 mg/mL的乳糖溶液，混勻。于−55 ℃預凍12 h后，放入凍干機中，于溫度為−45～−30 ℃真空干燥約48 h，緩慢升溫至25 ℃，保持6 h即得Mag-SLN凍干粉。 2.7 3種制劑體外溶出情況比較 取Mag-PC、Mag-SD和Mag-SLN凍干粉適量（厚樸酚含有量均為10.0 mg），采用溶出介質(zhì)制備混懸液后，轉(zhuǎn)移至透析袋中（截留相對分子質(zhì)量為8000～12 000）。采用含0.1%的聚山梨酯80的pH值為4.5醋酸鹽緩沖液作為溶出介質(zhì)，體積為900 mL，轉(zhuǎn)速為100 r/min，溫度為37 ℃。各時間點取樣3 mL，及時補加空白介質(zhì)3 mL。HPLC測定厚樸酚的含量，計算累積溶出度，繪制溶出曲線，結(jié)果見圖7。厚樸酚原料藥在12 h內(nèi)的累積溶出度為30.6%，而Mag-SD、Mag-SLN和Mag-PC分別將厚樸酚的12 h內(nèi)累積溶出度提高至96.3%、76.4%、45.9%。在初始階段，Mag-SD溶出速率最快，而Mag-PC和Mag-SLN具有明顯的緩釋特征，但Mag-SLN在各個時間點的累積溶出度均高于Mag-PC或厚樸酚原料藥。 圖片 2.8 SD大鼠體內(nèi)藥動學研究 2.8.1 分組及血樣采集 取24只大鼠，雌雄兼用，隨機分為4組即厚樸酚組、Mag-PC組、Mag-SD組和Mag-SLN組，給藥劑量均為80 mg/kg。實驗前全部禁食1 d，不禁水。準備肝素浸潤的離心管若干，各組實驗大鼠于ig給藥后0.17、0.33、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12 h眼眶靜脈叢取血約0.2～0.3 mL，置于肝素化離心管，震蕩混勻后，立即3 000 r/min離心2 min，于−20 ℃條件下冷凍保存血漿。 2.8.2 血漿樣品的處理[9] 取SD大鼠，麻醉后心臟取血，離心后取上層血漿，即得空白血漿，備用。精密吸取200 μL解凍后血漿樣品于離心管中，加醋酸乙酯1.0 mL，渦旋震蕩3 min，靜置1 min后繼續(xù)渦旋震蕩3 min。8 000 r/min離心2 min后取上層有機相，45 ℃條件下氮氣吹干。加入甲醇200 μL，10 000 r/min離心6 min，即得血漿樣品溶液。其中藥動學研究HPLC流動相調(diào)整為甲醇-水（58∶42），其他色譜條件均不變�？瞻籽獫{、血漿樣品和血漿對照品HPLC色譜圖見圖8。 圖片 2.8.3 血漿對照品的配制及線性關(guān)系考察 采用空白血漿配制質(zhì)量濃度為30.5、61.0、122.0、305.0、610.0、1 220.0 ng/mL的一系列厚樸酚血漿對照品溶液。按照“2.8.2”項方法處理，即得血漿對照品溶液，取20 μL進HPLC。以質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），進行線性回歸后得回歸方程Y＝0.013 1 X－5.357 3，r＝0.999 1。結(jié)果表明，厚樸酚在30.5～1 220.0 ng/mL線性關(guān)系良好。 2.8.4 方法學驗證 取血漿樣品于0、12、24、48、60、72 h經(jīng)反復冷凍、溶解后進HPLC色譜儀測定厚樸酚峰面積，計算得RSD值為10.38%，說明血漿樣品在72 h內(nèi)經(jīng)反復冷凍、溶解后仍基本穩(wěn)定。 選30.5、610.0、1 220.0 ng/mL3個質(zhì)量濃度血漿對照品溶液作為低、中、高質(zhì)量濃度。分別連續(xù)進樣6次，即得日間精密度的RSD值依次為11.36%、9.69%、7.03%（n＝6）；每天進樣1次，連續(xù)6 d，即得日內(nèi)精密度RSD值依次為8.11%、6.84%、6.03%（n＝6）。 采用空白血漿配制30.5、610.0、1 220.0 ng/mL 3個質(zhì)量濃度的血漿樣品，經(jīng)處理后進HPLC色譜儀測定峰面積，按照回歸方程Y＝0.013 1 X－5.357 3，計算測定值，與實際配制質(zhì)量濃度相比得出的回收率分別為90.69%、95.42%、91.97%，對應(yīng)的RSD分別為7.66%、8.84%、9.16%。所以建立的血漿處理方法及色譜方法可用于血漿樣品中厚樸酚的含量測定。 2.8.5 體內(nèi)藥動學研究 取厚樸酚組、Mag-PC組、Mag-SD組和Mag-SLN組血漿樣品，按照“2.8.2”項下方法處理后進行含量測定，并繪制藥-時曲線，結(jié)果見圖9。采用DAS2.0藥動學軟件包自動擬合數(shù)據(jù)，結(jié)果見表1。厚樸酚組的tmax、Cmax、AUC0～t分別為（0.78±0.23）h、（429.67±53.12）ng/mL、（1 217.81±153.29）ng∙h/mL。制備成Mag-SD后，其tmax顯著性提前至（0.49±0.16）h，而Mag-SLN組的tmax顯著性延后至（1.26±0.34）h，Mag-PC組的tmax為（0.86±0.28）h，有所延后，但不具有顯著差異（P＞0.05）。Mag-PC組、Mag-SD組和Mag-SLN的Cmax分別提高至（533.62±59.01）、（721.73±103.44）、（1 063.21±108.22）ng/mL，且均有顯著性差異（P＜0.05、0.01），說明3種制劑均可促進厚樸酚體內(nèi)吸收。與厚樸酚原料藥組相比，Mag-PC組、Mag-SD組和Mag-SLN組的口服相對生物利用度提高至1.38、2.12、3.45倍。 圖片 圖片 3 討論 3.1 血漿樣品的處理 在藥動學研究中，血漿樣品的處理過程對實驗結(jié)果的準確性有較大影響。課題組曾經(jīng)考慮采用有機溶劑（甲醇、乙腈等）沉淀蛋白，再用醋酸乙酯萃取，但回收率僅僅在54.11%～68.79%。而采用醋酸乙酯直接萃取時，回收率反而增加至90.69%～95.42%。研究結(jié)果顯示[9]，厚樸酚與血漿蛋白之間可能會產(chǎn)生靜電作用力及氫鍵作用力等，導致有機溶劑沉淀蛋白時，厚樸酚與血漿蛋白結(jié)合較為緊密。因此，最終選擇醋酸乙酯直接萃取進行測定，且操作過程大為簡化。 3.2 藥物存在狀態(tài)對溶出及藥動學的影響 無定型狀態(tài)是一種特殊的晶型，當藥物以無定型狀態(tài)存在時，其各種理化性質(zhì)、溶出速率、生物利用度等往往得到較大改變[10]。由于制備方法或輔料的不同，可以得到不同的無定型狀態(tài)物質(zhì)。同一物質(zhì)不同無定型狀態(tài)的溶出速率、生物利用度情況等可能有所不同。本研究分別嘗試采用磷脂（Mag-PC）和PVP K30（Mag-SD）制備了厚樸酚2種無定型狀態(tài)物質(zhì)，但兩者在體外溶出和體內(nèi)吸收表現(xiàn)出較大差別。Mag-PC在整個體外溶出過程均比較非常緩慢，而Mag-SD僅用45 min左右時間實現(xiàn)幾乎全部溶出。 體內(nèi)藥動學研究結(jié)果顯示，Mag-SD的tmax顯著性提前，而Mag-PC的tmax卻無顯著性差異。Mag-PC組的相對生物利用度提高至1.38倍，而Mag-SD組提高至2.12倍。據(jù)報道[11-12]，PC的制備需要在非質(zhì)子溶劑中進行，當PC接觸水相（質(zhì)子溶劑）后，破壞了藥物與磷脂之間的氫鍵、范德華力等，導致藥物與磷脂之間發(fā)生解離，促吸收作用受到極大影響。因而在PC、SD和SLN 3種制劑中，PC生物利用度提高幅度相對較低。 3.3 納米技術(shù)提高生物利用度機制及優(yōu)勢 納米技術(shù)提高藥物生物利用度除了提高藥物溶解度及溶出度等有關(guān)外，還與SLN在體內(nèi)特殊的吸收機制有很大關(guān)系[13-16]。Mag-SLN的tmax顯著性延后，除了與SLN本身具有緩釋作用外，可能還與SLN在胃腸道壁上被暫時吸附或發(fā)生滯留有關(guān)[12,16]。與原料藥組相比，Mag-SLN組的口服相對生物利用度提高至3.45倍。雖然Mag-SD藥物溶出速率和溶出度最大，但生物利用度低于Mag-SLN，可能是胃腸道穩(wěn)定性、滲透性、pH值等因素影響了SD中藥物的順利吸收[17-19]。納米制劑的包裹作用能明顯提高藥物的穩(wěn)定性[20-22]，此外納米制劑通過減小粒徑，增加比表面積，增加溶解度及滲透性等改變了藥物的組織分布和藥動學行為，極大提高了生物利用度，也為藥效的提高奠定基礎(chǔ)[23]。雖然SLN促吸收效果更為明顯，但制備工藝復雜程度、設(shè)備條件及制劑技術(shù)等要求也相對較高。 參考文獻（略） 來 源：劉會珍，董丹丹，范明松．不同厚樸酚制劑的制備、表征及其在SD大鼠體內(nèi)藥動學行為比較 [J]. 中草藥, 2020, 51(17):4442-4448.
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