厚樸酚固體分散體的制備及生物利用度研究 | 厚樸酚固體分散體的制備及生物利用度研究 |
| 發(fā)布時(shí)間:2022-03-06 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):552 |
| 目的 采用熱熔擠出技術(shù)制備厚樸酚固體分散體，提高厚樸酚體外溶出度及大鼠體內(nèi)生物利用度。方法 通過(guò)溶解度參數(shù)篩選與厚樸酚相容性較好的4種載體共聚維酮S-630（PS-630）、羥丙基纖維素（HPC）、丙烯酸樹(shù)脂Eudragit EPO（EPO）和聚乙烯已內(nèi)酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus）用于制備不同載藥量的固體分散體。以體外溶出度為指標(biāo)，應(yīng)用差示掃描量熱分析（DSC）、X-射線(xiàn)衍射分析（XRPD）和紅外光譜（IR）表征所制備的固體分散體；采用UPLC-MS/MS評(píng)價(jià)大鼠口服厚樸酚固體分散體后體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為。結(jié)果 體外溶出度實(shí)驗(yàn)表明厚樸酚與PS-630、HPC和EPO這3種載體（質(zhì)量比1∶6）分別制備的固體分散體均能顯著提高厚樸酚的溶出度，且藥物都是以無(wú)定形分散在載體中。體內(nèi)生物利用度實(shí)驗(yàn)顯示，PS-630和HPC制得的固體分散體中厚樸酚的血藥峰濃度（Cmax）分別約為單體的5倍和2.3倍，藥時(shí)曲線(xiàn)下面積（AUC0~t）分別提高了37.22%和70.88%，而EPO體系則未見(jiàn)生物利用度的提升。結(jié)論 熱熔擠出技術(shù)可應(yīng)用于提高難溶性藥物厚樸酚的體外溶出度和體內(nèi)生物利用度。 厚樸酚（magnolol，Mag）是木蘭科植物厚樸的藥效成分之一，屬木脂素類(lèi)化合物，具有抗炎、抑菌、抗氧化[1-2]等作用。最新研究發(fā)現(xiàn)Mag在抑制腫瘤生長(zhǎng)、保護(hù)心血管、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗脂肪肝形成、降血糖、抗腹瀉等方面也擁有獨(dú)特的療 效[3-11]。但是Mag水溶性差，體內(nèi)溶出度小，導(dǎo)致其生物利用度不高，從而限制了其臨床應(yīng)用[12]。為了解決這個(gè)問(wèn)題，有研究者采用溶劑蒸發(fā)法分別制備了Mag固體分散體和磷脂復(fù)合物[13-14]；還有研究者通過(guò)乙醇注入法制備成Mag脂質(zhì)體[15]，上述研究均提高了Mag的溶出度，但都存在一些問(wèn)題，如溶劑殘留、重復(fù)性差、工業(yè)化生產(chǎn)難等。 熱熔擠出技術(shù)（HME）起源于塑料和高分子加工行業(yè)，近些年來(lái)因其操作過(guò)程中無(wú)需使用有機(jī)溶劑、藥物分散效果好、適合于工業(yè)化生產(chǎn)等[16-19]優(yōu)勢(shì)而被廣泛地應(yīng)用到藥物固體分散體的制備領(lǐng)域。最新研究還發(fā)現(xiàn)，相較于其他傳統(tǒng)的固體分散體制備方法，HME法制備的固體分散體表現(xiàn)出更優(yōu)秀的穩(wěn)定性[20]。本實(shí)驗(yàn)采用HME制備Mag固體分散體，以溶出度為指標(biāo)初步篩選載體和載藥量，并評(píng)價(jià)所得固體分散體的物理化學(xué)狀態(tài)。最后通過(guò)體內(nèi)生物利用度實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)熱熔擠出技術(shù)對(duì)難溶性藥物Mag生物利用度的提升作用。 1 儀器與材料 Process11熱熔擠出機(jī)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；200 F3型差示掃描量熱儀，德國(guó)耐士科技有限公司；D/max 2500/PC陽(yáng)極轉(zhuǎn)靶X射線(xiàn)衍射儀，日本理學(xué)公司；MPA傅里葉變換近紅外光譜儀，布魯克光譜儀器有限公司；ZRS-8GD智能溶出試驗(yàn)儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司；Waters2695高效液相色譜儀、Waters Acquity UPLC TQD超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀系統(tǒng)，美國(guó)沃特世科技有限公司；XP-6型百萬(wàn)分之一天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q Synthesis 108超純水儀，美國(guó)密理博公司；Vortex genie渦旋儀，美國(guó)Scientific Industries公司；TGL-16C高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。 Mag原料藥，批號(hào)20140513，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，西安天本生物科技有限公司；Mag對(duì)照品，批號(hào)110729-200412，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；山柰酚（kaempferol，Kae）對(duì)照品，批號(hào)K107144，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；共聚維酮S-630（PS-630）、羥丙基纖維素（HPC），美國(guó)亞什蘭公司；丙烯酸樹(shù)脂Eudragit EPO（EPO），德國(guó)德固賽公司；聚乙烯已內(nèi)酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus），德國(guó)巴斯夫公司；乳糖、葡萄糖，上�？�(lè)康公司；甲醇，國(guó)藥集團(tuán)化藥試劑有限公司；乙腈，質(zhì)譜純，美國(guó)默克公司；聚山梨酯80，南京化學(xué)試劑股份有限公司；重蒸水，自制。 SPF級(jí)SD大鼠24只，雄性，體質(zhì)量200～220 g，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（滬）2014-0001。 2 方法與結(jié)果 2.1 處方前研究 溶解度參數(shù)（δ）是判斷體系相容性的常用指標(biāo)之一[21]。Mag的δ通過(guò)基團(tuán)貢獻(xiàn)法使用Molecular Modeling Pro分子模型預(yù)測(cè)軟件計(jì)算，載體的δ主要由文獻(xiàn)得到[22]。研究表明，當(dāng)2種化合物的溶解度參數(shù)差（Δδ）＜7 MPa1/2時(shí)，Mag和載體顯示出良好的相容性，而當(dāng)Δδ＞10 MPa1/2時(shí)，2種物質(zhì)很可能不會(huì)相容[23]。Mag和各載體Δδ結(jié)果見(jiàn)表1，PS-630、HPC、EPO和Soluplus的Δδ＜7 MPa1/2，表明這些載體與藥物有較好的相容性；而乳糖、葡萄糖的Δδ＞10 MPa1/2則顯示它們很可能與藥物不會(huì)相容而成為兩相。因此，初步選擇了PS-630、HPC、EPO和Soluplus這4種載體，每種載體分別制備高、中、低3種載藥量的固體分散體（Mag/載體質(zhì)量比分別為1∶3、1∶6、1∶9）。 圖片 2.2 熱熔擠出制備Mag固體分散體 Mag的熔點(diǎn)為105.5 ℃，PS-630、HPC、EPO和Soluplus的熔點(diǎn)經(jīng)DSC測(cè)定均低于105.5 ℃。為了獲得一種半固體、透明的便于下游操作的擠出物，熱熔擠出機(jī)融化區(qū)的設(shè)定溫度一般要高于混合結(jié)晶物熔點(diǎn)15～30 ℃[24]。由于PS-630、HPC、EPO和Soluplus 4種載體的熔點(diǎn)均小于105.5 ℃，故雙螺旋擠出機(jī)加熱區(qū)段的溫度分別設(shè)定為105、120、120、120、120、120、120、105 ℃。螺桿轉(zhuǎn)速設(shè)定為80 r/min，待溫度達(dá)到設(shè)定值后，將混勻后的物料從加料口緩慢投入，物料擠出后，收集于鋁盤(pán) 中，冷卻，粉碎，過(guò)60目篩，置于干燥器內(nèi)室溫保存?zhèn)溆谩?br /> 2.3 溶出度實(shí)驗(yàn)初篩處方 2.3.1 色譜條件 Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（78∶22）；體積流量為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為294 nm；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。 2.3.2 溶出度測(cè)定 精密稱(chēng)取Mag、各載體與Mag物理混合物（PM，質(zhì)量比1∶6）、Mag與各載體制備的固體分散體（SD，各樣品中含Mag 20 mg），參照《中國(guó)藥典》2015年版中槳法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。溶出介質(zhì)為pH 4.5含0.1%聚山梨酯80的醋酸鹽緩沖液900 mL，轉(zhuǎn)速為75 r/min，溫度為（37.0±0.1）℃。分別于10、20、40、60、90、120、180、240、300、360、480 min取樣5 mL。樣品按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。 2.3.3 處方篩選 溶出度結(jié)果見(jiàn)圖1。PS-630體 系，不同載藥量的擠出物在180 min的累積溶出度（D180＝61.13%、71.51%、65.98%）約為Mag （D180＝21.88%）和相應(yīng)物理混合物（D180＝24.73%）的2.5倍，1∶6載藥量擠出物初始溶出速率要高于其他2種載藥量。HPC制得的擠出物中，1∶3、1∶6、1∶9 3種載藥量的擠出物D180分別為55.62%、67.90%、68.25%，各載藥量擠出物溶出性能都優(yōu)于Mag原料藥（D180＝21.88%）和相應(yīng)的物理混合物（D180＝22.41%）。然而，不同載藥量之間的溶出性能也有差異，由圖1可知，1∶3比例的擠出物的溶出速率及程度均低于1∶6及1∶9。EPO體系，不同載藥量擠出物都能夠較短時(shí)間內(nèi)迅速溶解并在10 min內(nèi)達(dá)到峰值，相應(yīng)物理混合物的累積溶出度在480 min內(nèi)也能達(dá)到擠出物的效果。Soluplus組的溶出曲線(xiàn)展現(xiàn)出了與其他3種載體不同的現(xiàn)象，可以看到由Soluplus制備得到的擠出物并不能提高M(jìn)ag的溶出度。 圖片 對(duì)HPC、PS-630和EPO 3種載體而言，1∶3載藥量擠出物的溶解性能要劣于1∶6和1∶9。其中PS-630和EPO 2種載體1∶6載藥量所得擠出物的溶出性能與1∶9載藥量相比并無(wú)明顯提升。因此選擇PS-630、HPC與EPO 3種載體，1∶6載藥量擠出物作下一步研究。 2.4 固體分散體的評(píng)價(jià) 2.4.1 差示掃描量熱法（DSC）分析 取樣品適量，置于鋁制坩堝中，以空白坩堝為參比物，N2為保護(hù)氣，升溫范圍為40～200 ℃，升溫速率為10 ℃/min，DSC圖譜見(jiàn)圖2。Mag在105.5 ℃處有1個(gè)尖銳的吸熱峰，對(duì)應(yīng)Mag熔點(diǎn)。PS-630物理混合物在98 ℃處有1個(gè)很小的吸熱峰，PS-630制備的擠出物中，105.5 ℃處的特征峰消失，說(shuō)明Mag是以無(wú)定形態(tài)分散于擠出物中。Mag在HPC和EPO物理混合物中的特征峰分別在99.5 ℃和105 ℃處，制備得到的擠出物在相應(yīng)位置的特征峰同樣消失，說(shuō)明Mag也是以無(wú)定形態(tài)存在的。 圖片 2.4.2 X-射線(xiàn)衍射（XPRD）分析 取適量樣品進(jìn)行XPRD實(shí)驗(yàn)。工作條件：Cu-Kα靶石墨單色器衍射束單色比，高壓40 kV，單流100 mA，掃描2θ角度為3°～80°，步長(zhǎng)0.02°，掃描速度為1°/min，結(jié)果見(jiàn)圖3。Mag在2θ為11.32°、13°、19.54°、19.8°、21.72°、23.02°、26.28°、26.72°和30.54°處有尖銳的晶體衍射峰。藥物與各載體物理混合物在相應(yīng)位置仍保留有這些特征峰，在3種載體制得的擠出物中，這些晶體衍射峰都消失了，說(shuō)明藥物均以非晶態(tài)分散于載體中，形成無(wú)定形態(tài)固體分散體，XPRD的結(jié)果與DSC一致。 圖片 2.4.3 紅外光譜（IR）分析 采用溴化鉀壓片法測(cè)定各樣品的IR，波數(shù)范圍4 000～400 cm−1，分辨率為4 cm−1。結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖中發(fā)現(xiàn)，Mag芳香環(huán)上O-H特征峰振動(dòng)位于3157 cm−1，脂肪族C=C伸縮振動(dòng)峰位于1640 cm−1，苯環(huán)伸縮振動(dòng)峰包括 1 610、1 490、1410 cm−1。PS-630紅外光譜顯示在1 737、1664 cm−1的有C=O伸縮振動(dòng)峰。Mag和PS-630的物理混合物光譜類(lèi)似于兩者紅外圖譜的組合圖，且在3157 cm−1仍可見(jiàn)較小的伸縮振動(dòng)。然而Mag與PS-630制備得的固體分散體在3157 cm−1處的伸縮振動(dòng)幾乎消失，說(shuō)明固體分散體中Mag與PS-630之間可能存在氫鍵。HPC在3480 cm−1處有O-H伸縮振動(dòng)，EPO在1730 cm−1處有C=O伸縮振動(dòng)。這2種基團(tuán)都有可能與Mag中的O-H在熱熔擠出過(guò)程中形成氫鍵。由圖4可知，Mag于3157 cm−1處的伸縮振動(dòng)在與2種聚合物形成的物理混合物中仍然可見(jiàn)，但在制備的固體分散體中伸縮振動(dòng)消失不見(jiàn)，說(shuō)明Mag與這2種聚合物在熱熔擠出過(guò)程中都可能形成了氫鍵。 圖片 2.5 大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究 2.5.1 血漿樣品的采集與處理 取SD大鼠24只，隨機(jī)分為4組，按照Mag 20 mg/kg劑量ig Mag原料藥、Mag-PS-630（1∶6）固體分散體、Mag-HPC（1∶6）固體分散體、Mag-EPO（1∶6）固體分散體。給藥后，分別于5、10、20、30、45 min及1、1.5、2、4、6、8、12、24 h眼眶取血0.5 mL，置于含有10 μL肝素鈉的1.5 mL EP管中，6 000 r/min離心6 min，取上清血漿，置于−20 ℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆�。取血漿100 μL，加入甲醇和內(nèi)標(biāo)（Kae）各10 μL，渦旋混合均勻，加入50 μL濃度為0.05 mol/mL的HCl溶液及1mL的醋酸乙酯溶液，渦旋混合5 min，14 000 r/min離心5 min后，取上清液800 μL，置減壓濃縮儀揮干醋酸乙酯，用100 μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋5 min，14 000 r/min離心10 min，取上清80 μL待測(cè)。 2.5.2 血漿樣品分析方法的建立 （1）色譜條件：Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；流動(dòng)相為乙腈-水（25∶75），體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。 （2）質(zhì)譜條件：電噴霧離子化（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描模式（MRM），負(fù)離子模式，離子源溫度150 ℃，脫溶劑溫度400 ℃，脫溶劑體積流量1000 L/h。Mag m/z 264.9/247.4，保留時(shí)間1.44 min；Kae m/z 284.8/92.8，保留時(shí)間0.84 min。 2.5.3 方法學(xué)驗(yàn)證 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與線(xiàn)性范圍：將對(duì)照品用流動(dòng)相稀釋成不同的質(zhì)量濃度梯度，取對(duì)照品10 μL，加入100 μL空白血漿中，按“2.5.1”項(xiàng)下血漿樣品處理方法處理，進(jìn)樣檢測(cè)，以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得回歸方程Y＝0.039 9 X＋1.191 3，r＝0.997 2，線(xiàn)性范圍1.045～1 070.500 ng/mL。 （2）專(zhuān)屬性：取大鼠空白血漿、空白血漿＋Mag對(duì)照品溶液＋內(nèi)標(biāo)溶液和給藥4 h后血漿樣品色譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖5。本實(shí)驗(yàn)中Mag與內(nèi)標(biāo)互不影響，且大鼠血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾Mag的測(cè)定。 圖片 （3）精密度與準(zhǔn)確度：精密吸取空白血漿100 μL，加入高、中、低質(zhì)量濃度（40、500、1 000 ng/mL）的對(duì)照品溶液10 μL，按“2.5.1”項(xiàng)下方法處理，每種濃度平行5份，處理3批，進(jìn)樣分析，計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果顯示Mag的日內(nèi)精密度RSD分別為11.48%、8.67%、9.27%，準(zhǔn)確度分別為107.32%、106.77%、99.45%；日間精密度RSD分別為13.5%、9.73%、12.38%，準(zhǔn)確度分別為106.74%、99.72%、103.45%。 （4）穩(wěn)定性：精密吸取空白血漿100 μL，加入高、中、低質(zhì)量濃度（40、500、1 000 ng/mL）的對(duì)照品溶液10 μL，各濃度平行5份，分別于以下條件保存：室溫放置12 h，−20 ℃凍存14 d，室溫反復(fù)凍融3次。上述樣品按“2.5.1”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，準(zhǔn)確度為96.07%～114.93%，穩(wěn)定性符合要求。 2.5.4 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)用DAS 3.0藥動(dòng)學(xué)軟件擬合，藥時(shí)曲線(xiàn)見(jiàn)圖6，經(jīng)非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（表2）。Mag單體給藥后，Cmax為（65.40±13.74）ng/mL，AUC0~t為（600.35±181.67）ng∙h/mL；Mag-PS-630固體分散體組、Mag-HPC固體分散體組、Mag-EPO固體分散體組Cmax分別為（304.59±136.48）、（151.75±26.37）、（83.49±22.37）ng/mL，AUC0~t分別為（823.81±152.63）、（1 025.90±149.93）、（477.30±159.46）ng∙h/mL。結(jié)果表明PS-630和HPC制得的固體分散體能顯著提高M(jìn)ag體內(nèi)Cmax和AUC0~t，Cmax分別約為Mag單體的5倍和2.3倍，AUC0~t分別提高了37.22%和70.88%。而EPO制得的固體分散體未見(jiàn)體內(nèi)生物利用度顯著性提高。 圖片 圖片 3 討論 實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)熱熔擠出制備的固體分散體相較于溶劑法、熔融法等傳統(tǒng)工藝表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性[25]。本實(shí)驗(yàn)篩選出PS-630和HPC 2種載體，采用熱熔擠出法制備了厚樸酚固體分散體，2種載體均能提高厚樸酚的體外溶出和大鼠體內(nèi)的生物利用度。 對(duì)于PS-630和HPC體系，物理混合物的溶出也有輕微的提高，原因?yàn)檫@2種載體均為親水性材料，具有增溶的作用，但相對(duì)于固體分散體，藥物并非以無(wú)定形態(tài)存在，故溶出的提升效果有限[26-27]。對(duì)于EPO體系，它能夠在酸性溶出介質(zhì)中迅速溶解，不會(huì)在藥物表面形成凝膠層阻礙溶出，使得物理混合物長(zhǎng)時(shí)間的溶出能夠達(dá)到固體分散體組的效果，這也使得EPO制備得的固體分散體在很短時(shí)間內(nèi)幾乎完全溶出[28]。Soluplus是一種專(zhuān)為熱熔擠出開(kāi)發(fā)的載體，它的PEG主鏈連接了疏水性基團(tuán)，使其水溶性較低，在溶出介質(zhì)中溶脹緩慢，導(dǎo)致分散在載體中的藥物難以溶出[29]。 在溶出度實(shí)驗(yàn)中，PS-630、HPC和EPO 3種載體制得的固體分散體均能顯著提高厚樸酚的溶出性能，但大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，由EPO制得的固體分散體未見(jiàn)生物利用度的提高。原因可能為EPO制得的固體分散體在胃中很快溶解形成過(guò)飽和溶液，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)胃黏膜上皮細(xì)胞所能吸收的質(zhì)量濃度范圍，剩余未吸收的藥物進(jìn)入腸道，隨著腸道pH的升高，EPO溶解度降低，形成凝膠，導(dǎo)致已經(jīng)溶解的藥物重新被包裹，使得藥物的吸收受到阻礙，從而導(dǎo)致生物利用度無(wú)提高[28]。 參考文獻(xiàn)（略） 來(lái) 源：李 杰，楊軍輝，蔣志濤，韓 怡，狄留慶，柳春娣. 厚樸酚固體分散體的制備及生物利用度研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(14):3337-3345.
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