厚樸配方顆粒藥渣中厚樸酚及和厚樸酚的提取純化研究 | 厚樸配方顆粒藥渣中厚樸酚及和厚樸酚的提取純化研究 |
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| 厚樸配方顆粒藥渣中厚樸酚及和厚樸酚的提取純化研究 周永康1,2,3史新元1張志強(qiáng)2,3董晨虹2,3 1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院2. 北京康仁堂藥業(yè)有限公司 3. 中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 摘 要 目的對經(jīng)過水提取的厚樸配方顆粒藥渣中厚樸酚及和厚樸酚進(jìn)行提取、純化研究。方法本文對厚樸配方顆粒生產(chǎn)后的藥渣進(jìn)行研究,借助大孔樹脂分離純化技術(shù)對藥渣中的脂溶性成分厚樸酚及和厚樸酚進(jìn)行提取、純化工藝的研究,實(shí)現(xiàn)中藥資源的再次利用。結(jié)果粗提物出膏率約為4.56%,其中和厚樸酚含量約為19.94%,厚樸酚含量約為35.83%,兩種酚的總含量約為55.77%。結(jié)論目前,全國厚樸配方顆粒年投料量約150噸,按《中國藥典》厚樸項(xiàng)下2.0%的含量標(biāo)準(zhǔn),可從廢棄的藥渣中提取厚樸酚及和厚樸酚3000公斤,按照50%純度的市場售價(jià)約1000元/kg,從廢棄的厚樸藥渣中,廢物再利用可產(chǎn)生300萬的效益。 近年來，隨著國內(nèi)外依賴中藥和天然藥物資源為原料的大健康產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，藥渣產(chǎn)生量劇增，但由于提取工藝、設(shè)備和管理因素的制約，藥渣等廢棄物未能得到有效利用，不僅造成資源浪費(fèi)，且導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重污染[1,2]。楊曉輝[3]對甘草廢渣中的成分進(jìn)行了鑒定。劉常青等[4]比較了丹參藥材與丹參藥渣中丹參酮ⅡA的含量，周萍等[5]測定了黃芪藥渣中黃芪甲苷的含量，結(jié)果均說明中藥藥渣仍有較大的再利用價(jià)值。中藥配方顆粒法定的提取溶媒為水溶液，其藥渣中還殘存有大量的脂溶性成分，資源的浪費(fèi)問題更為突出。 厚樸是中國常用中藥，厚樸酚、和厚樸酚是厚樸的兩種主要活性成分[6,7]。厚樸酚衍生物對結(jié)腸癌細(xì)胞有抑制作用，和厚樸酚對過氧化氫誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[8,9]，它們在新藥開發(fā)、臨床應(yīng)用環(huán)節(jié)有極大的潛力。但是，厚樸酚及和厚樸酚均為脂溶性成分，在配方顆粒生產(chǎn)過程中大多殘留于藥渣中，尚未得到有效利用。 本文以厚樸為研究對象，對其藥渣進(jìn)行提取、純化工藝的研究，為中藥渣的再利用提供借鑒。 1 儀器與試藥 1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀(日本島津株式會(huì)社);Labsolution DB工作站;十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(艾杰爾);ME104E電子天平(梅特勒·托利多儀器(上海)有限公司);98-1-B電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);XP-26電子天平[梅特勒·托利多儀器(上海)有限公司]。 1.2 試劑及試藥 厚樸藥材及藥渣由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供，從生產(chǎn)現(xiàn)場隨機(jī)抽取三批，標(biāo)記為厚樸藥渣-01、厚樸藥渣-02、厚樸藥渣-03，對應(yīng)的三批藥材標(biāo)記為厚樸藥材-01、厚樸藥材-02、厚樸藥材-03。 厚樸酚對照品(110729-201915，中國食品藥品檢定研究院)、和厚樸酚對照品(110730-201915，中國食品藥品檢定研究院);乙醇(分析純)、甲醇(分析純、色譜純)、蒸餾水。 2 方法和結(jié)果 2.1 藥渣中厚樸酚及和厚樸酚含量測定 2.1.1 對照品溶液及供試品溶液的制備方法 (1)對照品溶液的制備:取厚樸酚對照品、和厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為厚樸酚40μg/m L、和厚樸酚24μg/m L的溶液，即得;(2)供試品溶液制備:參照《中華人民共和國藥典(一部》，取厚樸藥渣，粉碎、過三號篩，取約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 m L，搖勻，密塞，浸漬24小時(shí)，濾過，精密量取續(xù)濾液5 m L，置25 m L量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。 2.1.2 色譜條件 參照《中華人民共和國藥典(一部》，色譜柱:C18柱(規(guī)格4.6×250 mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇:水(78:22);檢測波長為294 nm，流速為1.0 m L/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量4μL，理論板數(shù)按厚樸酚峰計(jì)算應(yīng)不低于3800。 2.1.3 系統(tǒng)適用性 分別吸取供試品及對照品溶液，按照2.1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜峰中，與厚樸酚及和厚樸酚對照品溶液色譜峰相同位置出峰，理論板數(shù)以厚樸酚峰計(jì)算不低于3800，且分離度較好，無拖尾，無干擾。 2.1.4 方法學(xué)考察 (1)線性關(guān)系考察:取厚樸酚對照品適量，加甲醇制成濃度為150μg/m L的溶液，作為厚樸酚對照品母液;分別精密吸取厚樸酚對照品母液1 m L、3 m L、5 m L、10 m L、15 m L、20 m L、25 m L，置于25 m L容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過;取和厚樸酚對照品適量，加甲醇制成濃度為100μg/m L的溶液，作為和厚樸酚對照品母液;分別精密吸取和厚樸酚對照品母液1 m L、3 m L、5 m L、10 m L、15 m L、20 m L、25 m L，置于25 m L容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過;精密吸取上述續(xù)濾液5%L，注入超高效液相色譜儀，按2.1.2項(xiàng)下色譜條件分別測定厚樸酚峰面積、和厚樸酚峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品的濃度為橫坐標(biāo)，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，求得厚樸酚回歸方程為y=5300.3x+169.42,R=0.9999，和厚樸酚回歸方程為y=5306.4x-101.65,R=0.9999，線性關(guān)系良好。(2)精密度試驗(yàn):精密稱取厚樸藥渣，按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.2項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)測定6次，分別計(jì)算厚樸酚、和厚樸酚色譜峰面積，結(jié)果顯示RSD分別為0.45%、0.12%，表明系統(tǒng)精密度良好。(3)重復(fù)性試驗(yàn):精密稱取同一批次厚樸藥渣6份，按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，分別計(jì)算厚樸酚、和厚樸酚色譜峰面積，結(jié)果顯示峰面積RSD分別為2.15%、1.12%，表明方法重復(fù)性良好。(4)穩(wěn)定性試驗(yàn):取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下的一供試品溶液，按2.1.2項(xiàng)下色譜條件分別在0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)進(jìn)行測定，計(jì)算厚樸酚、和厚樸酚色譜峰面積，結(jié)果顯示RSD分別為0.65%、0.22%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。(5)加樣回收試驗(yàn):精密稱取6份已知含量的同一批次樣品，按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同時(shí)加入對照品溶液，平行制成6份供試品溶液。按2.1.2項(xiàng)下色譜條件測定回收率及RSD。結(jié)果顯示厚樸酚為102.1%、和厚樸酚為97.7%。 2.1.5 厚樸藥渣樣品含量測定 對厚樸藥渣中殘留的成分含量進(jìn)行測定，具體見表1。結(jié)果可知，水煎煮提取后的厚樸中厚樸酚與和厚樸酚還有大量殘余，隨機(jī)抽取的三批藥渣中，兩者的殘留率在70%以上，且總含量均值為3.34%，高于藥典中厚樸藥材厚樸酚及和厚樸酚總量不得少于2.0%的標(biāo)準(zhǔn)限度。將厚樸藥渣作為廢棄物直接處理將對中藥資源造成極大浪費(fèi)。為此，下文將厚樸藥渣作為原料，進(jìn)行厚樸酚及和厚樸酚提取純化工藝研究。 表1 厚樸藥渣中厚樸酚、和厚樸酚含量測定結(jié)果 圖片 2.2 厚樸酚及和厚樸酚的提取工藝考察 2.2.1 提取方式優(yōu)選 以提出的厚樸酚及和厚樸酚總量為指標(biāo)，考察超聲法和回流法的提取效果。取厚樸藥渣粉末(過一號篩)共6份，每份約10 g，分別加入80%乙醇200 m L進(jìn)行超聲和加熱回流提取，提取時(shí)間為30分鐘、60分鐘、90分鐘，過濾，濾液減壓濃縮后，50℃真空干燥12小時(shí)，稱重，計(jì)算出膏率。取少量粉末，按照2.1下方法制備供試品溶液并進(jìn)行含量測定(具體見表2)。結(jié)果可知，以提取總量為評價(jià)指標(biāo)，回流顯著優(yōu)于超聲，故選擇回流法作為提取方法。 表2 厚樸提取方法比較結(jié)果 圖片 2.2.2 提取溶劑及次數(shù)優(yōu)選 以厚樸酚及和厚樸酚總含量為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選提取溶劑與提取次數(shù)。取厚樸藥渣4份，每份約10 g，以60%、80%乙醇分別回流提取1次、2次，每次加200 m L溶劑，回流30分鐘，合并提取液至500 m L容量瓶中，加相應(yīng)溶劑定容到刻度，取10 m L于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，用甲醇溶解，定容到50 m L，過濾，得供試品溶液，按2.1.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行含量測定(具體見表3)。結(jié)果可知，用60%乙醇提取優(yōu)于80%乙醇，提取2次優(yōu)于1次，故確定提取溶劑為60%乙醇，提取次數(shù)為2次。 表3 厚樸提取溶劑及提取次數(shù)考察結(jié)果 圖片 2.2.3 提取溶劑量優(yōu)選 以厚樸酚以及和厚樸酚總含量為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選提取溶劑量。溶劑倍量設(shè)定為10倍、15倍及20倍，其他過程同2.2.2(具體見表4)。結(jié)果可知，在本文所設(shè)條件范圍內(nèi)，隨著溶劑量增加，兩種酚的總含量呈增長趨勢，20倍為最優(yōu)。但溶劑倍量增加帶來的含量增加幅度并不大，考慮到提取溶劑成本，本文選定10倍量溶劑進(jìn)行提取時(shí)間考察，以期在較低的溶劑倍量下獲得較好的提取效果。 表4 厚樸提取溶劑量考察結(jié)果 圖片 2.2.4 提取時(shí)間優(yōu)選 以厚樸酚以及和厚樸酚含量的總量為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選提取時(shí)間。兩次提取時(shí)間分別為30分鐘、30分鐘;60分鐘、30分鐘;90分鐘、30分鐘;90分鐘、60分鐘，其他過程同前(具體見表5)。結(jié)果可知，用10倍量60%乙醇回流提取，隨著提取時(shí)間延長，提取液中厚樸酚、和厚樸酚及兩者總含量均逐漸增加，兩次提取時(shí)間為90分鐘、60分鐘時(shí)總含量為3.42%，提取已近乎完全，故確定提取時(shí)間分別為90分鐘、60分鐘。 表5 10倍溶劑量的提取時(shí)間考察結(jié)果 圖片 通過上述實(shí)驗(yàn)，確定最佳提取工藝為:10倍量60%乙醇回流提取2次，時(shí)間分別為90分鐘、60分鐘。 2.3 厚樸酚及和厚樸酚的分離純化 2.3.1 大孔樹脂型號篩選 采用靜態(tài)法，以樹脂的比吸附量和解析率為綜合評價(jià)指標(biāo)，對AB-8及D101兩種樹脂進(jìn)行優(yōu)選。(1)厚樸樣品液的制備:取100 g厚樸藥渣，按照2.2項(xiàng)下最佳提取工藝提取、過濾，減壓回收至無醇味，作為厚樸樣品液。(2)大孔樹脂的活化:采用乙醇濕法裝柱，在提取器中加入高于樹脂層10～20 cm的乙醇浸泡12小時(shí)，過濾，樹脂用乙醇反復(fù)洗至流出液加3倍量水不顯渾濁為止，再用大量蒸餾水洗至流出液無醇味備用。 吸附:稱取活化后的樹脂各20 g (濕重)，置250 m L錐形瓶中，分別加入50 m L厚樸樣品液，密塞，室溫振搖18小時(shí)，充分吸附后，抽濾，分別測定吸附前后的藥液中兩種目標(biāo)物質(zhì)的總量之和，計(jì)算比吸附量。比吸附量:Q=(C0-Ce)×V/W(注:Q:比吸附量mg/g;W:干樹脂重;V:溶液體積;C0:原樣品液濃度;Ce:吸附后溶液濃度)。 解析:吸附后的樹脂加入60%乙醇120 m L，恒溫振搖24小時(shí)，充分解析后，抽濾，測定濾液中兩種酚的總量，計(jì)算解析率(%)。解析率(%)=解析量/吸附量×100%。 表6為兩種樹脂對厚樸酚、和厚樸酚的吸附及解析情況考察結(jié)果。由表可知，AB-8與D101兩種大孔樹脂對兩種成分的比吸附量基本相同，但AB-8的解析率略優(yōu)于D101，故選擇AB-8型大孔樹脂。 2.3.2 吸附條件考察 (1)時(shí)間考察:稱取AB-8型大孔樹脂40 m L，加入制備好的厚樸樣品液，密塞，室溫振搖。在0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)分別用吸管吸取2 m L，測定其中目標(biāo)物質(zhì)的含量，確定吸附時(shí)間。由表7結(jié)果可知，吸附2小時(shí)，吸附已近乎完全，故確定吸附時(shí)間為2小時(shí)。 (2)上樣量考察:取130 m L樹脂濕法裝入3 cm×38 cm的玻璃柱，以4 BV/h的速度上厚樸樣品液，每100 m L為1份流出液，測定其中厚樸酚及和厚樸酚的量，繪制泄漏曲線。結(jié)果見表8、圖1。 由泄漏曲線可知，該吸附條件下和厚樸酚最大上樣量為600 m L，厚樸酚在上樣500 m L出現(xiàn)明顯泄漏，故最大上樣量應(yīng)在500 m L左右。為避免過載，確定最大上樣量為400 m L，折合樹脂與生藥的比為1∶0.26(m L/g)。通過上述實(shí)驗(yàn)，確定AB-8型大孔樹脂純化厚樸的最佳條件為:上樣量為樹脂與生藥比1∶0.26(m L/g)，吸附時(shí)間2小時(shí)。 表6 大孔樹脂純化厚樸樹脂型號考察結(jié)果 圖片 表7 大孔樹脂純化厚樸吸附時(shí)間考察結(jié)果 圖片 表8 大孔樹脂上樣量考察結(jié)果 圖片 2.3.3 洗脫條件考察 (1)濃度考察:裝柱及上樣操作過程同2.3.2，上樣完成后靜置2小時(shí)以充分吸附。洗脫:將已吸附好的樹脂先用蒸餾水(2BV)洗至無色，再用20%乙醇(2BV)、40%乙醇(2 BV)、60%乙醇(4 BV)、80%乙醇(4 BV)、95%乙醇(4BV)依次洗脫。分段收集洗脫液，測定厚樸酚與和厚樸酚的量，優(yōu)選洗脫溶劑，結(jié)果見圖2。由圖2可知，厚樸酚、和厚樸酚用80%乙醇洗脫時(shí)，有較高的洗脫量，因此選擇80%乙醇作為洗脫液。 (2)用量考察:裝柱及上樣方法同上。洗脫:將已吸附好的樹脂先用蒸餾水洗至無色，再用80%乙醇洗脫，流速為4BV/h。分段收集洗脫液，測定厚樸酚與和厚樸酚的總量，確定洗脫劑最佳用量，結(jié)果見圖3。由圖3可知，和厚樸酚在8BV基本洗脫完全，而厚樸酚在10BV基本洗脫完全;綜合考慮兩種酚的總量和經(jīng)濟(jì)性，選取10BV為洗脫劑用量。 通過上述實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選出的最佳洗脫條件為:先用水洗至無色(約2 BV)，再用10 BV的80%乙醇洗脫。 最終確定厚樸藥渣中厚樸酚及和厚樸酚的提取純化工藝為:取厚樸藥渣，用10倍量60%乙醇回流提取2次，時(shí)間分別為90分鐘、60分鐘，過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味后，用AB-8型大孔樹脂分離純化，上樣量為樹脂與生藥比1∶0.26(m L/g)，吸附2小時(shí)后，先用水洗至無色(約2 BV)，后用80%乙醇(10 BV)洗脫，合并洗脫液、減壓濃縮、干燥，得厚樸粗提取物。經(jīng)測定:粗提物出膏率約為4.56%，其中和厚樸酚含量約為19.94%，厚樸酚含量約為35.83%，兩種酚的總含量約為55.77%。 圖片 圖1 大孔樹脂純化厚樸的泄漏曲線 圖片 圖2 大孔樹脂純化厚樸洗脫液濃度考察結(jié)果 圖片 圖3 洗脫液用量考察趨勢結(jié)果 3 討論 中藥配方顆粒是以傳統(tǒng)的中藥湯劑為物質(zhì)基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒而成。配方顆粒法定的提取溶媒為水溶液，不添加任何有機(jī)溶劑。因此配方顆粒所產(chǎn)生的藥渣中，還殘存有大量的脂溶性成分。而中藥配方顆粒目前生產(chǎn)品種約600余種，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)幾乎所有的藥材中均含有脂溶性成分，目前配方顆粒的藥渣多被作為廢棄物進(jìn)行處理，尚未有有效的處理方式，造成中藥資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，也造成了環(huán)境污染問題。筆者通過對大黃、丹參、葛根、黃芪、夏枯草等一系列品種的研究，提供了一種藥渣處理、重復(fù)利用的思路，并以厚樸為例闡述了經(jīng)中藥配方顆粒提取工藝后，廢棄藥渣中殘留的脂溶性成分厚樸酚以及和厚樸酚的再次提取純化工藝。所得的粗提取物可進(jìn)一步純化至較高純度的單體化合物可出口至海外，亦可用于化妝品行業(yè)、獸藥行業(yè)等下游市場。 隨著中國中醫(yī)藥事業(yè)的快速發(fā)展，預(yù)計(jì)中醫(yī)藥大健康產(chǎn)業(yè)將有望達(dá)到3萬億元。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前中國中藥材年產(chǎn)量約7000萬噸，而在制藥企業(yè)進(jìn)行工業(yè)化加工生產(chǎn)過程中，產(chǎn)生的中藥廢棄藥渣可達(dá)3500萬噸。中藥配方顆粒也保持了快速增長態(tài)勢，2006～2019年中藥配方顆粒全國銷售額由2.28億元上升到125億元，在2021年市場規(guī)模有望增加到約200億元，未來幾年有望達(dá)400億。隨著配方顆粒市場的發(fā)展，生產(chǎn)所用的藥材年投料量也將由目前的上百萬噸繼續(xù)翻倍增長，再加上經(jīng)典名方的開發(fā)上市，中藥藥渣的產(chǎn)生量會(huì)持續(xù)上升，采用填埋、焚燒、固定區(qū)域堆放等措施會(huì)對周圍的水質(zhì)、土壤和空氣造成嚴(yán)重的污染，影響環(huán)境質(zhì)量，且耗費(fèi)大量資金。近年來，愈加突出和嚴(yán)重的藥渣排放和處理問題，正成為制約中藥制藥行業(yè)發(fā)展的問題之一[10]。因此需要對中藥材資源進(jìn)行更加高效率的利用。
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