RP-HPLC測(cè)定單體綠原酸的含量 | RP-HPLC測(cè)定單體綠原酸的含量 |
| 發(fā)布時(shí)間:2011-12-26 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):2627 |
RP-HPLC測(cè)定單體綠原酸的含量
【摘要】 目的 應(yīng)用反相高效液相色譜法測(cè)定單體綠原酸的含量。方法 流動(dòng)相：0.1%甲酸-乙腈(92:8)(pH 2.6)，色譜柱：C18(250×4.6 mm,5 μm)，測(cè)定波長(zhǎng)：323 nm。結(jié)果 綠原酸在2.50 μg·ml-1～125.00 μg·ml-1范圍內(nèi)線性良好，平均回收率為100.9%。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】 反相高效液相色譜法 單體綠原酸 綠原酸 金銀花提取物 上禾生物綠原酸 金銀花綠原酸 金銀花提取物綠原酸
Determinatiom of Chlorogenic Acid Monomer by RP- HPLC LIAO Li-yun1,2,XU Xiao-ping2,TIAN Chen-xu2,REN Xia2,TAN Pei2 (1.Department of Pharmaceutics,Chengdu Medical college,Chengdu 610083,China;2.West China School of Pharmacy,Sichuan University,Chengdu 610041,China) Abstract：Objective To determinate the content of CHA for high-purified raw materials by reversed phase high performance liquid chromatography.Methods HPLC condition was C18 column(250×4.6 mm,5μm)with the mixture of acetonitrile- water( containing 0.1% formic acid)(92∶8)(pH2.6)as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1 with the detection wavelength at 323 nm.Results The method proved to be linear over the range of 2.50μg·ml-1～125.00μg·ml-1.The average recovery of the assay was 100.9 %.Conclusion The method appeared to be simple,reliable and accurate,and it could be used for the quality control of the preparation. Key words:RP-HPLC;chlorogenic acid monomer;determination 綠原酸(Chlorogenic acid，CHA)，又名3-O-咖啡�？鼘幩�(3-O-caffeoylquinnic acid)是廣泛存在于植物中的一種多酚類化合物，其中忍冬類、杜仲、咖啡等植物中含量較高。具有較強(qiáng)的抗變態(tài)反應(yīng)[1]、調(diào)節(jié)體內(nèi)血糖[2]、清除氧自由基[3]及抗癌抗HIV[4]等作用，由于其療效顯著、毒副作用小而引起廣泛研究[5,6,7]。 雖然綠原酸是中藥中最常見(jiàn)的化合物，但是由于其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，純化困難。在眾多的研究文獻(xiàn)中主要報(bào)道了綠原酸作為中成藥主要成分的形式進(jìn)行分析和含量測(cè)定[8-13]。另外關(guān)于綠原酸共存物的研究有少量報(bào)道[6,7]，但研究對(duì)象多為產(chǎn)品粗提物(含量15%～30%)，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)的單體綠原酸(含量≥99%)的研究，尚少見(jiàn)報(bào)道。而現(xiàn)今從杜仲葉中經(jīng)過(guò)提取加工得到的綠原酸其純度可達(dá)98%。為便于生產(chǎn)質(zhì)量上的控制，本文采用高效液相色譜法測(cè)定高純度綠原酸的含量，方法簡(jiǎn)便、精確、重現(xiàn)性好，為單體綠原酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究控制提供了科學(xué)依據(jù)。 1 實(shí)驗(yàn)部分 1.1 儀器和試藥 高效液相色譜儀、LC-6A型高壓泵和SPD-10Avp型UV-VIS檢測(cè)器(日本島津公司)。UV-2201紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。pHS-25型酸度計(jì)(上海雷磁儀器九廠);綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);綠原酸原料藥(批號(hào)：010801，010802，010803)由四川九章生物化工科技發(fā)展有限公司提供;乙腈為色譜純;超純水;其余試劑均為分析純。 1.2 色譜條件的選擇 1.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 由綠原酸流動(dòng)相中的紫外掃描圖譜可知，綠原酸在波長(zhǎng)的217.4，232.8和323.6nm處有最大吸收與對(duì)照品一致。以保證溶液中存在的物質(zhì)盡可能分離檢出為目的，比較三個(gè)波長(zhǎng)條件下得出峰的情況，波長(zhǎng)323 nm既能檢出所有組分，同時(shí)受溶劑影響更小。故確定為本試驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)為323 nm。 1.2.2 流動(dòng)相與色譜柱選擇 精密稱取于105℃干燥至恒重的本品10 mg，加水 100 ml，使溶解，作為供試品溶液。采用不同型號(hào)C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為323 nm，調(diào)節(jié)流動(dòng)相乙腈-水比例、水相pH值，取供試液10μl注入色譜儀，記錄色譜圖。流動(dòng)相考察了不同乙睛比例、不同pH值對(duì)色譜行為的影響。結(jié)果表明，乙腈比例的變化對(duì)待測(cè)組分保留時(shí)間影響明顯，乙腈對(duì)組分峰的銳度影響明顯，pH值的下降可減少色譜峰的拖尾現(xiàn)象，相對(duì)提高柱效。最后確定流動(dòng)相為0.1%甲酸-乙腈(92∶8)(pH 2.6)。 采用十八烷基鍵合硅膠柱，對(duì)色譜柱Aichroma bandAQ、Zichrom、Hi-tech kromasil、Dikma Diamond、Gemini 150×4.6 mm，5 μm等進(jìn)行比較篩選。結(jié)果表明：十八烷基鍵合硅膠柱皆能獲得較好的綠原酸色譜峰，其中Aichroma bandAQ柱柱效最高，柱壓較低，理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算大于5 000, 綠原酸與雜質(zhì)完全分離，分離度大于1.5。確定為本試驗(yàn)色譜柱。 根據(jù)流動(dòng)相及色譜柱的篩選，確定色譜條件為：色譜柱：Aichroma bandAQ C18柱;流動(dòng)相：0.1%甲酸-乙腈(92∶8)(pH 2.6)，檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm，流速1.0 ml·min-1，柱溫30℃。 1.3 方法和結(jié)果 1.3.1 溶液的制備 精密稱取于105℃干燥至恒重的綠原酸對(duì)照品約6.25 mg，置50 ml的量瓶中，加上述流動(dòng)相溶解定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液貯備液(綠原酸125.0 μg·mL-1)。 精密稱取于105℃干燥至恒重的樣品約20 mg，置于25 ml量瓶中，加上述流動(dòng)相溶解定容，搖勻。再精密吸取1 ml于10 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解定容，搖勻，即得樣品溶液。 1.3.2 專屬性的考察 分別取陰性樣品溶液、綠原酸對(duì)照品溶液和樣品溶液10 μl，注入色譜儀(圖1)。 圖1 陰性樣品(A)、綠原酸對(duì)照品(B)和樣品(C)的色譜圖 Fig.1 HPLC chromatograms of blank sample(A)、CHA reference(B)and sample(C) 1.3.3 線性關(guān)系的考察和最低檢測(cè)限 取綠原酸對(duì)照品貯備液，溶解定容成125.00 μg/ml、75.00 μg/ml、50.00 μg/ml、25.00 μg/ml、12.50 μg/ml、2.50 μg/ml的系列溶液。各取10 μl注入色譜儀，按“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以樣品濃度對(duì)峰面積進(jìn)行回歸，結(jié)果表明綠原酸在濃度2.50 μg·ml-1～125.00 μg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。回歸方程為：A=44,696C-24,377(r =0.9993)。 將綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品稀釋液逐漸稀釋進(jìn)樣測(cè)定，本品在信噪比S/N≥3時(shí)，最低檢出量為 0.38 ng。 1.3.4 精密度試驗(yàn) 精密量取綠原酸對(duì)照品溶液10μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得綠原酸峰面積的RSD=0.82%,表明儀器精密度良好。 1.3.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“1.3.1”項(xiàng)下樣品溶液1份，每隔2 h分別進(jìn)樣10 μl，測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果在12 h內(nèi)峰面積的RSD=0.97%，表明樣品溶液穩(wěn)定性良好。 1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“1.3.1”項(xiàng)下方法，對(duì)同一批樣品，平行制備樣品溶液6份，分別測(cè)定綠原酸的含量，求得含量得RSD=0.43%，表明分析方法重復(fù)性較好。 1.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取于105℃干燥至恒重的樣品適量，精密稱定19.60 mg，按“1.3.1”項(xiàng)下方法配制得樣品溶液。分別取樣品溶液1ml于9個(gè)10 ml量瓶中，分成三組，再分別加入濃度為125.0 μg·ml-1對(duì)照品溶液各0.4 ml、0.5 ml、0.6 ml，各取10 μl，按“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各濃度對(duì)應(yīng)色譜峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。表1 回收率測(cè)定結(jié)果 1.3.8 樣品的含量測(cè)定 按“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件，各取對(duì)照品和樣品溶液10 μl進(jìn)樣，按照外標(biāo)法，以峰面積計(jì)。測(cè)定3批樣品 (批號(hào)010801、010802、010803)的含量，結(jié)果標(biāo)示百分含量為99.90%、100.7%、99.28%，RSD分別為 0.61%、1.00%、0.28%(n=3)。 2 討論 2.1 由色譜條件篩選以及重復(fù)性、重現(xiàn)性等考察結(jié)果表明，本品在不同ODS色譜柱，不同流動(dòng)相，不同色譜儀和不同操作人員等因素，皆能獲得分離較好的綠原酸色譜峰，以難分離的雜質(zhì)(如咖啡酸)對(duì)綠原酸分離作為評(píng)判指標(biāo)，采用0.1%的甲酸pH在2～3之間，綠原酸柱效達(dá)到5 000以上，綠原酸共存雜質(zhì)的干擾可較好的排除，滿足含量測(cè)定的要求。 2.2 含量測(cè)定時(shí)，分別采用了經(jīng)典容量滴定法、紫外分光光度法和高效液相色譜法對(duì)本品的含量測(cè)定。UV法:本品是由咖啡酸和奎尼酸縮合的縮酚酸，結(jié)構(gòu)中有共軛基團(tuán)，能產(chǎn)生紫外特征吸收，可用紫外分光光度法測(cè)定其含量。酸堿滴定法: 本品是由咖啡酸和奎尼酸縮合的縮酚酸，具有游離羧基，可采用堿滴定液直接滴定，結(jié)果見(jiàn)表2。 比較結(jié)果表明，三種方法對(duì)綠原酸含量測(cè)定結(jié)果基本一致，但是由于綠原酸來(lái)源于植物，在生產(chǎn)、儲(chǔ)運(yùn)等過(guò)程中，可能會(huì)產(chǎn)生共存雜質(zhì)和降解產(chǎn)物，同時(shí)本品存在的有關(guān)物質(zhì)如咖啡酸與本品具有類似結(jié)構(gòu)和紫外吸收等，酸堿滴定法和UV法的選擇性相對(duì)較差，造成測(cè)定結(jié)果的偏離。而HPLC法則通過(guò)分離后對(duì)綠原酸組分進(jìn)行定量，可以較好的選擇測(cè)定綠原酸成分，并能有效地避免共存雜質(zhì)的干擾。所以本試驗(yàn)最后采用高效液相譜法作為本品的最終含量測(cè)定方法。所采用的含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、快速、靈敏。
【參考文獻(xiàn)】 [1]Hemmerle H,Burger H J,Below P,et al.Chlorogenic Acid and Synthetic Chlorogenic Acid Derivatives:Novel Inhibitors of Hepatic Glucose-6-phosphate Translocase[J].J Med Chem,1997,40(2):137-145. [2]Schindle P W,Below P,Hemmerle H,et al.Identification of New Inhibitors of Hepatic Glucose-6-phosphate Ranslocase[J].Diabetologia,1994,37[suppl.1]:A134. [3]Ohnishi M，Morishita H,Iwahashi H,et al.Inhibitory Effects of Chlorogenic Acids on Linoleic Acid Peroxidation and Haemolysis [J].Phytochemistry,1994,36(3):579-583. [4]Sengupta A,Ghosh S,Das S.Tomato and Garlic Can Modulate Azoxymethane-induced Colon Carcino -genesis in Rats[J].European Journal of Cancer Prevention,June 2003,12(3):195-200.
綠原酸Chlorogenic acid327-97-9 綠原酸（氯原酸,咖啡鞣酸）對(duì)照品 綠原酸98%,30%,25% 杜仲提取物Eucommia Ulmoides P.E. 熊果酸Ursolic acid 77-52-1 熊果酸對(duì)照品 熊果酸（烏索酸 烏蘇酸）98%,95%,90%,25%,10% 枇杷葉提取物L(fēng)oquat Leaf P.E 金銀花提取物HoneySuchle Flowers Extract 綠原酸（氯原酸,咖啡鞣酸）Chlorogenic acid 327-97-9綠原酸98%,6%,5% 淫羊藿提取物 Epemidium Extract 淫羊藿甙、淫羊藿甙Icariin 489-32-7 淫羊藿甙60-98% 淫羊藿甙對(duì)照品 大花紫薇提取物Banaba P.E 科羅索酸corosolic acid4547-24-4 科羅索酸對(duì)照品 科羅索酸1-98% 苦杏仁提取物Bitter Apricot Seed P.E 苦杏仁苷 苦杏仁甙 Amygdalin29883-15-6 苦杏仁甙98%HPLC 大黃素（朱砂蓮甲素）Emodin 大黃提取物 大黃素5-98% 藤茶提取物Ampelopsis grossedentataP.E 二氫楊梅素（雙氫楊梅素 二氫楊梅樹(shù)皮素）Dihydromyricetin 27200-12-0 楊梅素 楊梅樹(shù)皮素Myricetin 楊梅樹(shù)皮提取物529-44-2 丹參提取物Salvia root P.E 丹參酮IIA Tanshinone ⅡA568-72- 9 98% HPLC 隱丹參酮 327-97-9;77-52-1;489-32-7;4547-24-4;29883-15-6;528-82-1;27200-12-0;529-44-2;529-44-2;528-43-8;35354-74-6 528-43-8 35354-74-6 長(zhǎng)沙上禾生物科技有限公司 24小時(shí)客戶熱線：13875855783 網(wǎng)站：www.csnutilities.com 電話：86-0731-84213302 18975172140 MSN:jiehua0501@hotmail.com E-MAIL: jiehua0501@gmail.com staherb@staherb.com 地址：長(zhǎng)沙麓谷高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū) 上禾生物科技---專注植提，精于高純，基于您對(duì)天然產(chǎn)物需求持續(xù)創(chuàng)新 |
