小兒清熱利肺口服液中總綠原酸的含量測(cè)定方法研究 | 小兒清熱利肺口服液中總綠原酸的含量測(cè)定方法研究 |
| 發(fā)布時(shí)間:2011-12-26 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):3019 |
|
作者：魏大華1，馮敬文2，王四元1，龍曉英2，陳金愛(ài) 1 作者單位：(1.廣州潘高壽藥業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 511400; 2.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東廣州 510006) 【摘要】 目的 建立反相高效液相色譜法測(cè)定小兒清熱利肺口服液中總綠原酸的含量。方法 采用DiamonsiLTM C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，乙腈體積分?jǐn)?shù)0.4%H3PO4水溶液(體積比10∶90)為流動(dòng)相，流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm,柱溫為30 ℃。結(jié)果 綠原酸在質(zhì)量濃度為16.28～81.4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 6，n=5)，樣品平均回收率為100.31%，RSD為1.45%。結(jié)論 本法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，適用于小兒清熱利肺口服液的質(zhì)量控制。 【關(guān)鍵詞】 金銀花提取物綠原酸 上禾生物綠原酸 小兒清熱利肺口服液;高效液相色譜法;綠原酸;含量測(cè)定 Determination of total chlorogenic acid in Xiaoer Qingre Lifei oral solution by HPLC WEI Dahua1，F(xiàn)ENG Jingwen2，WANG Siyuan1，LONG Xiaoying2，CHEN Jinai1(1.Guangzhou Pangaoshou Pharmaceutical Company Limited,Guangzhou,Guangdong 511400,China; 2.School of TCM,Guangdong Pharmaceutical College,Guangzhou,Guangdong 510006,China) Abstract:Objective To establish a RPHPLC method for the determination of total chlorogenic acids in Xiaoer Qingre Lifei ioral solution. Methods The assay was performed on DiamonsiLTM C18 column with the mobile phase of acetonirile0.4% phosphoric acid solution (10∶90) under a flow rate of 1 mL·min-1. The detection wavelength was set at 327 nm and column temperature was 30 ℃. Results It showed good linearity in the range of 16.28-81.4 μg of chlorogenic acid (r=0.999 6,n=5).The average recovery was 100.31% (RSD=1.45%). Conclusion The method is simple,rapid,accurate and can be used for the determination of total chlorogenic acids in Xiaoer Qingre Lifei oral solution. Key words:Xiaoer Qingre Lifei oral solution; HPLC; chlorogenic acid; determination 小兒清熱利肺口服液由銀翹散和麻杏石甘湯2個(gè)古方合方化裁而成，處方由金銀花、連翹、牛蒡子、麻黃、等11味中藥組成[1]，主治外感風(fēng)熱邪在肺衛(wèi)或衛(wèi)氣同病之風(fēng)熱咳嗽，用于發(fā)熱、咳嗽，咯痰、流涕或鼻塞、咽痛、口渴、舌紅黃等證候的小兒急性支氣管炎。其中綠原酸為金銀花的主要活性成分，在牛蒡子中含量亦較高。它是一種具有廣泛生理和藥理活性的物質(zhì)，具有利膽、抗菌、降壓、增加白細(xì)胞及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、降脂、清除自由基等多種藥理作用[2]。小兒清熱利肺口服液現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用紫外分光光度法測(cè)定其鹽酸麻黃堿含量，并未以綠原酸為含量測(cè)定指標(biāo)。因此，本實(shí)驗(yàn)建立高效液相色譜法測(cè)定小兒清熱利肺口服液中總綠原酸的含量，旨在為完善小兒清熱利肺口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)。 1 儀器與試藥 LC20A高效液相色譜儀(日本島津)，SPD紫外檢測(cè)器，二元高壓梯度泵;BP211D電子分析天平(Satorius);UV2450可見(jiàn)紫外分光光度儀(日本島津); HH6恒溫水浴鍋(宏華新佳);綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110753200413);小兒清熱利肺口服液(廣州潘高壽藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)：E06002、F03002B、F10001B、I11002B);乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。 魏大華,等.小兒清熱利肺口服液中總綠原酸的含量測(cè)定方法研究 2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件 色譜柱：DiamonsiLTM C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱;流動(dòng)相：乙腈體積分?jǐn)?shù)0.4% H3PO4水溶液(體積比10∶90);流速：1 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。 2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品(于室溫用P2O5干燥24 h)8.14 mg，置20 mL棕色容量瓶中，加50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。精密吸取綠原酸對(duì)照品貯備液2 mL置于25 mL容量瓶中，用50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇稀釋制成每1 mL含綠原酸 0.032 6 mg的對(duì)照品溶液。 2.3 供試品溶液的制備 精密吸取小兒清熱利肺口服液1 mL至分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取4次，每次10 mL，合并正丁醇層于70 ℃水浴蒸干，殘?jiān)?0%(體積分?jǐn)?shù))甲醇溶解，定容至50 mL容量瓶中，搖勻，用0.45 μm微孔薄膜濾過(guò)，即得。 2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 稱取處方組成中除金銀花和牛蒡子外的其余藥材，按照生產(chǎn)工藝制備陰性樣品，并按“2. 3”項(xiàng)下方法制備，即得陰性對(duì)照溶液。 2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別緊密吸取對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液各20 μL注入液相色譜儀中，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。在此條件下，陰性對(duì)綠原酸測(cè)定無(wú)干擾，綠原酸和其他組分可達(dá)到基線分離，分離度R>5。理論塔板數(shù)以綠原酸計(jì)，應(yīng)不低于 1 000。結(jié)果見(jiàn)圖1。 2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2”項(xiàng)下綠原酸對(duì)照品貯備液各1、2、3、4、5 mL，分別至25 mL棕色容量瓶中，加50%(體積分?jǐn)?shù))甲醇稀釋至刻度，搖勻，得綠原酸質(zhì)量濃度分別為16.28、32.56、48.84、65.12、81.4 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液。分別精密吸取20 μL進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，綠原酸對(duì)照品量(X，μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程為： Y=6.2465×104X-3.6896×104，r=0.999 6。 結(jié)果表明,綠原酸在16.28～81.4 μg范圍內(nèi)，與峰面積呈良好線性關(guān)系。 2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定綠原酸峰面積，結(jié)果RSD值為1.51%(n=5)，表明儀器精密度良好。 2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品(批號(hào)E06002)溶液，于0、4、8、12、18、24 h分別進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積。結(jié)果RSD值為1.60%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。 2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(批號(hào)F03002B)小兒清熱利肺口服液6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果綠原酸含量的RSD值為0.19%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。 2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取小兒清熱利肺口服液(批號(hào)I11002B)適當(dāng)稀釋后的藥液共6份(綠原酸質(zhì)量濃度為0.842 7 mg·mL-1)，分別加入綠原酸對(duì)照品溶液適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定綠原酸的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 2.11 樣品測(cè)定 取小兒清熱利肺口服液3批 (批號(hào)E06002、F03002B、F10001B)，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算綠原酸的含量。結(jié)果3個(gè)批號(hào)樣品的質(zhì)量濃度分別為2.331、1.861、1.928 mg·mL-1，RSD值依次為0.48%、1.09%和0.77%。 3 討論 3.1 綠原酸為金銀花的特征有效成分。本實(shí)驗(yàn)在去除金銀花的陰性對(duì)照液中檢測(cè)出較高含量的綠原酸(見(jiàn)圖2)，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)綠原酸在牛蒡子中含量較高。曾有關(guān)于在牛蒡葉中提取綠原酸的文獻(xiàn)報(bào)道[3]，但未見(jiàn)牛蒡子中檢測(cè)出綠原酸的報(bào)道。本研究這一發(fā)現(xiàn)不僅提高了牛蒡子藥材的可利用度，同時(shí)也可作為其質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。 3.2 對(duì)綠原酸對(duì)照品溶液在200～400 nm處進(jìn)行紫外光譜掃描檢測(cè)，結(jié)果顯示綠原酸在217、240、327 nm處均有最大吸收，選擇干擾較少的327 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。 3.3 對(duì)不同比例的乙腈H3PO4水溶液[4]作為流動(dòng)相的分離效果進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)二者的體積比為10∶90，綠原酸與相鄰雜質(zhì)峰分離效果最好，保留時(shí)間適中。H3PO4水溶液的體積分?jǐn)?shù)為0.4%時(shí)，峰形對(duì)稱。因此，選擇乙腈體積分?jǐn)?shù)0.4% H3PO4水溶液(體積比10∶90)作為流動(dòng)相。 3.4 小兒清熱利肺口服液為11味中藥組成的大復(fù)方，成分非常復(fù)雜，因而，供試品制備方法的選擇難度較大。曾嘗試用甲醇對(duì)樣品液進(jìn)行超聲提取，提取液直接進(jìn)樣檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，綠原酸峰與其它雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離耗時(shí)較長(zhǎng)，且由于目標(biāo)峰后還有較多雜質(zhì)峰，為不干擾下一樣品的檢測(cè)必須等待90 min以上才可進(jìn)樣。為改善分離效果，對(duì)甲醇提取液采用中性氧化鋁柱柱與大孔吸附樹(shù)脂[5]進(jìn)行純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者分離純化的效果并不理想，且操作繁瑣。故嘗試使用溶劑萃取法對(duì)樣品進(jìn)行處理，并對(duì)乙酸乙酯與水飽和正丁醇的萃取[2]效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，2種溶劑所得萃取液的色譜圖基本相同，峰形、峰時(shí)一致，但乙酸乙酯萃取液的峰面積較小，說(shuō)明乙酸乙酯萃取時(shí)綠原酸損失較多，其主要原因是綠原酸微溶于乙酸乙酯。因此，確定樣品采用水飽和正丁醇萃取，不僅能有效去除雜質(zhì)，且綠原酸損失較少，操作簡(jiǎn)便、快速。 對(duì)萃取溶劑用量與萃取次數(shù)考查結(jié)果表明，20倍水飽和正丁醇萃取2次與15倍水飽和正丁醇萃取3次所得萃取液中綠原酸的含量較低;10倍水飽和正丁醇萃取3次較20、30倍水飽和正丁醇萃取3次所得萃取液中綠原酸的含量低;10倍水飽和正丁醇萃取4次所測(cè)得綠原酸含量與20、30倍水飽和正丁醇萃取3次的含量基本一致，且高于5倍水飽和正丁醇萃取4次的含量。因此，確定水飽和正丁醇用量為10倍量，萃取次數(shù)為4次。 3.5 本研究建立的綠原酸含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便快速、分離度好、靈敏度高，可用于小兒清熱利肺口服液的質(zhì)量控制。
【參考文獻(xiàn)】 [1] 易明娟,謝子清,譚億明,等.清熱利肺口服液的藥理研究[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),1997,20(4):35-39. [2] 劉軍海,裘愛(ài)泳,任惠蘭.綠原酸提取與純化分離方法研究進(jìn)展[J].糧食與油脂,2007,(7):42-45. [3] 楊麗芬.牛蒡葉綠原酸提取工藝、分離純化及對(duì)病原真菌的活性研究[D].山東大學(xué),2007. [4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:205. [5] 李欣榮,曹志勝,柏茗.中藥制劑中綠原酸測(cè)定樣品預(yù)處理方法研究[J].中國(guó)中藥雜志,1997,22(4):220-221.
綠原酸Chlorogenic acid327-97-9 綠原酸（氯原酸,咖啡鞣酸）對(duì)照品 綠原酸98%,30%,25% 杜仲提取物Eucommia Ulmoides P.E. 熊果酸Ursolic acid 77-52-1 熊果酸對(duì)照品 熊果酸（烏索酸 烏蘇酸）98%,95%,90%,25%,10% 枇杷葉提取物L(fēng)oquat Leaf P.E 金銀花提取物HoneySuchle Flowers Extract 綠原酸（氯原酸,咖啡鞣酸）Chlorogenic acid 327-97-9綠原酸98%,6%,5% 淫羊藿提取物 Epemidium Extract 淫羊藿甙、淫羊藿甙Icariin 489-32-7 淫羊藿甙60-98% 淫羊藿甙對(duì)照品 大花紫薇提取物Banaba P.E 科羅索酸corosolic acid4547-24-4 科羅索酸對(duì)照品 科羅索酸1-98% 苦杏仁提取物Bitter Apricot Seed P.E 苦杏仁苷 苦杏仁甙 Amygdalin29883-15-6 苦杏仁甙98%HPLC 大黃素（朱砂蓮甲素）Emodin 大黃提取物 大黃素5-98% 藤茶提取物Ampelopsis grossedentataP.E 二氫楊梅素（雙氫楊梅素 二氫楊梅樹(shù)皮素）Dihydromyricetin 27200-12-0 楊梅素 楊梅樹(shù)皮素Myricetin 楊梅樹(shù)皮提取物529-44-2 丹參提取物Salvia root P.E 丹參酮IIA Tanshinone ⅡA568-72- 9 98% HPLC 隱丹參酮 327-97-9;77-52-1;489-32-7;4547-24-4;29883-15-6;528-82-1;27200-12-0;529-44-2;529-44-2;528-43-8;35354-74-6 528-43-8 35354-74-6 長(zhǎng)沙上禾生物科技有限公司 24小時(shí)客戶熱線：13875855783 網(wǎng)站：www.csnutilities.com 電話：86-0731-84213302 18975172140 MSN:jiehua0501@hotmail.com E-MAIL: jiehua0501@gmail.com staherb@staherb.com 地址：長(zhǎng)沙麓谷高新技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū) 上禾生物科技---專注植提，精于高純，基于您對(duì)天然產(chǎn)物需求持續(xù)創(chuàng)新 |
