遠(yuǎn)明1,劉穎菊2*,王夢(mèng)華2,高麗佳2
(1遂寧市中心醫(yī)院,四川遂寧629000;2重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室,重慶400016)
摘要:目的:通過(guò)建立高脂血癥脂肪肝動(dòng)物模型,探討杜仲葉醇提取物(alcohol extractive of Folium Eucommiae,AEFE)對(duì)脂肪肝的防治作用。方法:高脂飲食8周加維生素D36×105IU/kg分3d腹腔注射，建立大鼠高脂血癥脂肪肝動(dòng)物模型。各給藥組從造模第3周開(kāi)始分別灌胃給予洛伐他汀(4mg·kg-1·d-1)、 AEFE(70、140和420mg·kg-1·d-1),共給藥6周。各組每天灌服等量生理鹽水，灌胃容積為0.5mL/100g體重。結(jié)果:AEFE用藥6周后顯示,各劑量組血清膽固醇、甘油三酯和游離脂肪酸、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶均較模型組明顯降低(P<005),肝組織丙二醛含量降低和超氧化物歧化酶活性升高,肝脂肪變性和炎癥反應(yīng)減輕,尤以中劑量組作用最明顯(P<001)。AEFE對(duì)肝內(nèi)腫瘤壞死因子α濃度無(wú)明顯影響。結(jié)論:AEFE改善高脂性大鼠肝臟脂肪變性,此作用可能與其降血脂、抗氧化損傷有關(guān)。
關(guān)鍵詞:杜仲葉;脂肪肝;氧化應(yīng)激;腫瘤壞死因子 杜仲葉提取物 杜仲提取物 杜仲綠原酸 長(zhǎng)沙上禾生物杜仲提取物
近年來(lái),隨著人們生活水平的提高,由飲食導(dǎo)致的脂肪肝發(fā)病率逐漸增高,除控制飲食、增強(qiáng)體育鍛煉外,有效的藥物治療也是必要的,但目前仍缺乏理想的藥物。中醫(yī)中藥是我國(guó)巨大的醫(yī)藥寶庫(kù),在綜合降脂保肝治療中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。為尋找有效的治療藥物,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠脂肪肝模型,以洛伐他汀為陽(yáng)性對(duì)照藥,觀察杜仲葉醇提取物(alcohol extractive of Folium Eucommiae,AEFE)對(duì)高脂性脂肪肝的保護(hù)作用及機(jī)制。
1材料與方法
11材料
111動(dòng)物:雄性Sprague Dawley大鼠,體重200~250g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(醫(yī)學(xué)動(dòng)物合格證:SCXK渝20020003)。
112藥品與試劑AEFE:根據(jù)文獻(xiàn)［1］制備并濃縮至100％(相當(dāng)于1mL含生藥1g)備用,由重慶醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室提供并鑒定。洛伐他汀:由重慶大新藥業(yè)股〖KG(0.20mm〗份有限公司提供,批號(hào)040501。丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測(cè)定試劑盒:南京建成生物工程研究所。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)試劑盒:解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放射免疫所。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
表1AEFE對(duì)大鼠血清脂質(zhì)水平及轉(zhuǎn)氨酶的影響(±s,n=8)
表2AEFE對(duì)大鼠肝脂肪變性和炎癥活動(dòng)度的影響?yīng)?/P>
113實(shí)驗(yàn)儀器:MoDular p800型全自動(dòng)生化分析儀:瑞士羅氏公司;722型可見(jiàn)光分光光度計(jì):上海菁華科技儀器有限公司。SN695B型放射免疫測(cè)定儀:上海核輻光電儀器設(shè)備有限公司。
12方法
121實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組,每組8只:正常組,模型組,陽(yáng)性藥物組,高、中、低劑量AEFE治療組。飼養(yǎng)于二級(jí)動(dòng)物房,自由飲水。
122模型復(fù)制:參考文獻(xiàn)［2］方法建立大鼠高脂血癥脂肪肝模型:于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)給予模型組及各給藥組大鼠腹腔注射Vit D3注射液(總劑量6×105IU/kg,分3d給完),同時(shí)開(kāi)始給予模型組及各給藥組大鼠高脂飼料(配方:3％膽固醇,05％豬膽鹽,02％丙硫氧嘧啶,5％白糖,10％豬油,813％基礎(chǔ)飼料),共8周。正常組飼普通基礎(chǔ)飼料。各給藥組從造模第3周開(kāi)始灌胃給藥,陽(yáng)性藥物組給洛伐他汀(4mg·kg-1·d-1),AEFE治療組分別給AEFE 70、140和420mg·kg-1·d-1，共給藥6周。正常組與模型組每天灌服等量生理鹽水，灌胃容積為05mL/100g體重。
123標(biāo)本采集及測(cè)定:給藥6周后最后一晚禁食,不禁水。次日將各組大鼠麻醉后心臟采血,分離血清,全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總膽固醇(total cholesterols,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST);取肝右葉制備10%肝勻漿,3000r/min,離心10min后取上清液比色法測(cè)定肝組織MDA含量和SOD活力,放免法測(cè)定肝內(nèi)TNFα濃度;同時(shí)取肝臟左葉10%甲醛固定,石蠟包埋切片,HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察肝脂肪變性程度和炎癥活動(dòng)度［3］。
藥物治療肝脂肪變性療效判定分為治愈率和有效率。治愈率是指肝臟脂肪變程度為“-”所占的比率,有效率是指肝臟脂肪變程度為“-”~“+”所占的比率。
124統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有結(jié)果均以±s表示,數(shù)據(jù)采用SPSS130統(tǒng)計(jì)軟件分析處理,兩組比較用t檢驗(yàn),多組比較用單因素方差分析,等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。
2結(jié)果
21AEFE對(duì)血脂及轉(zhuǎn)氨酶的影響:模型組大鼠血清TC、TG、FFA、ALT和AST較正常組均明顯升高(P<001);AEFE各劑量組及陽(yáng)性藥物組以上指標(biāo)與模型組相比均降低,差別具有顯著性(P<001)(表1)。
22AEFE對(duì)肝臟病理變化的影響:
AEFE各劑量組和陽(yáng)性藥物組的肝脂肪變性程度和炎癥活動(dòng)度較模型組減輕,以AEFE中劑量組最明顯,治療肝脂肪變性的有效率達(dá)625%,但各組治愈率均為0(表2)。
23AEFE對(duì)肝勻漿MDA、SOD和TNFα的影響:與正常組相比,模型組肝臟中MDA和TNFα明顯升高,SOD活性明顯降低(P<001)。各用藥組MDA濃度較模型組明顯降低,SOD活性明顯高于模型組(P<005),以AEFE中劑量組最顯著,但各用藥組與模型組相比TNFα雖有下降趨勢(shì),統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異(表3)。
3討論
近年來(lái)認(rèn)為高脂飲食引起過(guò)多脂肪攝入,脂肪在肝內(nèi)外過(guò)多貯積,引起胰島素抵抗和血漿游離脂肪酸增加,致使肝內(nèi)反應(yīng)氧、自由基生成增多,促發(fā)肝細(xì)胞凋亡、壞死,繼之引起肝內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)一步增強(qiáng),形成惡性循環(huán),加速脂肪肝炎的形成，這是高脂飲食致脂肪肝的主要發(fā)病機(jī)制［4］。在此過(guò)程中TNFα參與了脂肪肝的發(fā)生、發(fā)展［5］:高濃度的TNFα可促進(jìn)外周組織脂肪動(dòng)員,使血中游離脂肪酸增加,肝細(xì)胞TG的合成及聚集增加;當(dāng)血中及肝內(nèi)的游離脂肪酸增多時(shí),游離脂肪酸又可使TNFα表達(dá)增加,并加強(qiáng)TNFα等細(xì)胞因子的毒性,引起線粒體功能不全、肝細(xì)胞損傷。
表3AEFE對(duì)大鼠肝勻漿MDA、SOD和TNFα的影響?yīng)?/P>
本實(shí)驗(yàn)采用高脂、高膽固醇飼料加Vit D3的混合方式造模8周,結(jié)果顯示模型組大鼠肝臟脂肪變性程度和炎癥活動(dòng)度計(jì)分增高,同時(shí)血清TC、TG、FFA、轉(zhuǎn)氨酶明顯升高,肝臟MDA和TNFα含量增加,SOD活性明顯降低。此結(jié)果說(shuō)明該方法能在短時(shí)間內(nèi)成功造模,且該模型與人類肥胖、高脂血癥相關(guān)性脂肪肝的表現(xiàn)極為相似,也進(jìn)一步證實(shí)脂肪肝的發(fā)生與脂質(zhì)過(guò)氧化、FFA和TNFα增高有關(guān)。
杜仲是我國(guó)特有的滋補(bǔ)中藥材,其味甘、性溫,久服能輕身耐老、延年益壽,具有提高機(jī)體抗缺氧耐力、改善機(jī)體免疫功能、降低血脂、平衡調(diào)節(jié)血壓等功效［6］。杜仲傳統(tǒng)以皮入藥,但樹(shù)皮生長(zhǎng)周期很長(zhǎng),難以滿足人們的需求。近年的研究證明,杜仲葉與杜仲皮的有效成分基本相同［7］,AEFE同樣具有降低血脂、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗動(dòng)脈粥樣硬化等功效［8,9］。本研究結(jié)果顯示AEFE在降低血清TC、TG的同時(shí),FFA、ALT、AST明顯降低,肝臟脂肪變性和炎癥反應(yīng)明顯減輕,說(shuō)明AEFE對(duì)高脂性脂肪肝有治療作用。同時(shí)AEFE也使肝MDA減少,SOD活性增強(qiáng),提示AEFE可通過(guò)改善脂質(zhì)代謝,減少FFA的生成,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)發(fā)揮對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示AFFE中劑量組(140mg·kg-1·d-1)效果最好,這提示中劑量已達(dá)最大效應(yīng)。另外,AEFE各劑量對(duì)肝臟中TNFα含量無(wú)明顯影響,這可能與用藥的療程和開(kāi)始給藥的時(shí)間有關(guān),需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究;AEFE只能減輕肝脂肪變性但不能完全逆轉(zhuǎn)肝臟的脂肪變性,所以有效率可達(dá)625%,而治愈率為零。
綜上所述,AEFE具有良好的降血脂、改善脂質(zhì)過(guò)氧化、減輕肝脂肪變性的作用,有希望開(kāi)發(fā)為單用或與其它藥物組方的、有效的治療脂肪肝藥物。
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杜仲葉提取物對(duì)大鼠高脂性脂肪肝的實(shí)驗(yàn)觀察 
