杜仲葉醇提物（杜仲提取物）預防去勢大鼠骨質疏松癥的實驗研究 | 杜仲葉醇提物（杜仲提取物）預防去勢大鼠骨質疏松癥的實驗研究 |
| 發(fā)布時間:2011-12-26 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):2673 |
| 者：白立煒 作者單位：新鄉(xiāng)醫(yī)學院一附院內分泌科，河南 衛(wèi)輝 453100
【摘要】 目的：通過去卵巢大鼠骨質疏松模型，研究杜仲葉醇對骨密度和血清雌激素、IL-6水平的影響。方法：切除雌性Wistar大鼠雙側卵巢建立骨質疏松動物模型，給予杜仲葉醇灌胃，治療12周后，檢測大鼠骨密度、血清雌激素、IL-6水平。結果：去勢后大鼠骨密度降低，采用杜仲葉醇治療后骨密度、血清雌二醇（E2）含量顯著升高（P<0.05），IL-6水平顯著下降（P<0.05）。結論：杜仲葉醇可顯著提高去勢大鼠骨密度和血清雌激素水平，對血清IL-6水平有抑制作用。 【關鍵詞】 骨質疏松 實驗性/藥物療法 骨密度/藥物作用 雌二醇 IL-6 杜仲/類似物衍生物 杜仲/治療作用 杜仲葉醇 杜仲提取物 杜仲葉提取物 杜仲綠原酸 杜仲葉綠原酸 上禾生物綠原酸 上禾生物杜仲提取物 (Department of endocrinology of the first affiliated hospital of Xinxiang Medical College, Henan 453100, China) 【Abstract】 Objective：To study the effect of Duzhongyechun on the bone mineral density of rats without ovaria and the level of estrogen, IL-6 in serums through the osteoporosis models of the rats. Methods:Reproduce the osteoporosis model of ovariectomized Wistar rats and receive Duzhongyechun therapy. After 12 week therapy bone mineral density, serum estrogen and IL-6 were measured.Results: The bone mineral density of ovariectomized rats decreased significantly. Compared with the model group, the bone mineral density and the content of serum estrogen (E2) increased significantly（P<0.05）, the content of serum IL-6 decreased remarkably （P<0.05）after 12 week therapy using Duzhongyechun.Conclusions: Duzhongyechun can notably increase the bone mineral density and the content of serum estrogen of rats without ovaria, control the levels of IL-6 in serum. 【Key words】Osteoporosis; Experimental/Pharmacotherapy; Bone mineral density/Drug action; Estrogen; IL-6; DuZhong/Analogue derivative; Duzhong/Therapeutic action; Duzhongyechun; Rats 1 材料與方法 1.1 動物 普通級Wistar大鼠48只，體重280～320 g，雌性，購于河南省實驗動物中心，隨機分成4組，每組12只，即正常對照組、模型對照組、西藥尼爾雌醇對照組、杜仲葉醇提物治療組，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。 1.2 藥品 1.2.1 杜仲葉醇提物制備 取新鮮杜仲葉5 kg，切細，在60 ℃條件下烘干后用水煎煮，待藥液濃縮到1：1濃度時分兩次遞進加入濃度為60%、80%的乙醇，進行2次醇沉處理，濾液于水浴上蒸發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈后，用緩沖液調節(jié)PH值到7.0，再用蒸餾水稀釋至每ml含1g生藥，濾清后于10磅/平方時壓力下滅菌30分鐘，然后放置到4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/P> 1.2.2 尼爾雌醇（nilestriol，CEE3），化學名3-環(huán)戊醚，北京四環(huán)制藥二廠合格產(chǎn)品。 1.3 主要試劑及儀器 Rat ELISA IL-6試劑盒由美國ENDOGEN試劑公司生產(chǎn)，中國科學院上海原子核研究所生產(chǎn)的雌二醇放免分析試劑盒，中國原子能科學研究院生產(chǎn)的BMD 400E型骨密度掃描儀，中國科學院上海原子核研究所生產(chǎn)的FMJ-182放射免疫計數(shù)器，CODA全自動酶免分析儀：由美國BIO-RAD公司制造。 1.4 模型制作方法 模型對照組、西藥對照組、杜仲葉醇提物組用戊巴比妥鈉麻醉（40 mg/kg，腹腔注射），下腹部剪毛，消毒后剪開約1.5 cm的正中切口，行雙側卵巢結扎切除術，逐層縫合，術后肌注青霉素預防感染。正常對照組除未行卵巢結扎切除，而取腹腔內左右各一塊脂肪外，其余步驟同前。 1.5 給藥途徑 西藥對照組給予尼爾雌醇1.5 mg/kg，每周灌胃1次，其余6天灌等量蒸餾水；杜仲葉醇提物組給予杜仲葉醇提物生藥6 g/kg。次灌胃，每日1次。每周按大鼠的公斤體重校正給藥劑量，共12周；正常對照組和模型對照組給予等量蒸餾水灌胃。 1.6 標本采集及測定方法 1.6.1 實驗結束，以1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，剖開鼠腹，從后腔靜脈采血，離心取血清，每份血清分裝2～3個冷凍管中，每管1～2 ml，置-80 ℃低溫冰箱保存，待用。剝離雙側股骨，剔除附著的軟組織，用10%福爾馬林固定，用BMD 400E型骨密度掃描儀測量股骨中、上段1/3處1 cm范圍內的線密度（BWD）、面密度（BMD）和骨干直徑（BD）。 1.6.2 檢測血清中雌二醇（E2）的含量 采用放射免疫法，按試劑盒說明書進行操作。 1.6.3 檢測血清中IL-6的含量 采用夾心法ELISA檢測，步驟如下： (1)包被 將稀釋好的包被抗體加入Elisa板100 μl/孔，4 ℃放置48小時。 (2)加待測標本 洗滌液沖洗Elisa板3次，加待測樣品，陰性對照組及倍比稀釋的標準品，100 μl /孔，37 ℃ ，1小時。標準品稀釋方法：取標準IL-6，先用稀釋液做4倍稀釋，再倍比稀釋為9個濃度：20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ ml和1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，0.156 ng/ml， 0.078 ng/ml。 (3)加酶標抗體 (4)顯色 洗板3次，加入配好的ABTS顯色液，100 μl/孔，室溫或37 ℃，顯色15～30分鐘。 (5) Elisa讀數(shù)儀測410 nm處OD值，繪制標準曲線。 1.7 統(tǒng)計學處理 所測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩個樣本均數(shù)的比較采用t檢驗。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行處理，各項參數(shù)間比較，P<0.05為有統(tǒng)計學差異。 2 結果 2.1 各組大鼠股骨線密度、面密度和骨干直徑測定結果（表1） 從表1可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠股骨的線密度、面密度顯著下降（P<0.05），骨干直徑亦有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；西藥對照組的線密度、面密度和骨干直徑不顯著下降（P>0.05），杜仲葉醇提物組的線密度、面密度和骨干直徑顯著下降（P<0.05）。與模型對照組比較，西藥對照組的線密度、面密度顯著升高（P<0.05），骨干直徑不顯著升高（P>0.05），杜仲葉醇提物組的線密度、面密度顯著升高（P<0.05），骨干直徑不顯著升高（P>0.05）。與西藥對照組比較，杜仲葉醇提物組的線密度、面密度、骨干直徑均降低，但無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。表1 大鼠股骨線密度、面密度和骨干直徑的變化(略) 2.2 各組大鼠雌二醇（E2）、IL-6含量測定結果（表2）表2 大鼠E2 、IL-6的變化(略) 與正常對照組比較，模型對照組和杜仲葉醇提物組的大鼠血清E2均顯著降低（P<0.05），西藥對照組下降不顯著；與模型對照組比較，西藥對照組和杜仲葉醇提物組的大鼠血清E2顯著升高。與正常對照組比較，模型對照組、西藥對照組和杜仲葉醇提物組的大鼠血清IL-6含量均顯著升高；與模型對照組比較，西藥對照組和杜仲葉醇提物組的大鼠血清IL-6含量均顯著降低；西藥對照組和杜仲葉醇提物組的大鼠血清IL-6含量差異無顯著性。 3 討論 絕經(jīng)后骨質疏松（postmenopausal osteoporosis， PMO）是老年婦女�；嫉囊环N代謝性骨病，雌激素水平的明顯下降是導致PMO的主要原因，因此PMO的防治多用雌激素替代療法，但長期應用不良反應大，療效不肯定［1，2］。中藥治療骨質疏松在我國具有悠久的歷史，選用不良反應小，療效高的藥物治療骨質疏松是醫(yī)學的重要研究課題之一。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨”、“精足則髓足”髓在骨內，髓足則骨強，故若腎精虧損，則髓無以養(yǎng)，而致骨質疏松，所以骨質疏松癥其本在骨，屬骨痿，是由于腎虛所致，腎主骨生髓，腎虛則骨空，日久發(fā)為骨痿，故補益肝腎為治療骨痿的重要原則。傳統(tǒng)中藥杜仲是名貴滋補藥材，具有“補益肝腎，堅筋骨，輕身耐老”的功效。 骨密度是評價骨強度判斷的指標,是確定骨質疏松癥最基本的依據(jù)。本實驗結果顯示,將Wistar 雌性大鼠去卵巢后使其體內雌激素水平明顯下降，到術后12 w模型對照組大鼠股骨線密度、面密度均顯著低于正常對照組，成功復制骨質疏松模型，而杜仲葉醇提物組和西藥尼爾雌醇組的大鼠的股骨線密度、面密度比模型對照組顯著升高,說明杜仲葉醇提物和尼爾雌醇均可增加大鼠骨密度，與馬中書等報道的結果一致［3］。 雌激素是主要由卵巢分泌的一種激素,可以通過調控骨質再形成的細胞因子網(wǎng)絡及一些體液因子對骨髓微環(huán)境及破骨細胞和成骨細胞發(fā)揮精細的調節(jié)作用來維持骨量的平衡。Bain［4］及Chow 等［5］認為對去卵巢小鼠使用高劑量雌激素,雌激素不但抑制骨吸收,而且刺激骨形成。從表2 可以看出, 與正常對照組比較, 模型對照組血清中的雌激素有明顯下降(P<0.05)，與模型對照組比較, 尼爾雌醇組, 杜仲葉醇提物組血清中的雌激素明顯升高(P<0.05)，說明去除卵巢導致血清中的雌激素水平明顯下降, 造模成功, 應用尼爾雌醇及杜仲葉醇提物進行干預, 可提高血清中的雌激素水平 , 進而對抗去卵巢后的骨質疏松癥，也提示杜仲葉醇提物可能具有弱雌激素樣作用。 IL-6為分子量26 KD含有184個氨基酸的蛋白質,可由成骨細胞、破骨細胞、造血干細胞、基質細胞、單核細胞分泌， IL-6的功能是促進破骨細胞生成,可使顆粒- 巨噬集落刺激因子(GM - CSF)增生,與其他骨吸收因子共同作用,促進骨吸收。文獻報道在骨質疏松的發(fā)病機制中雌激素減少后出現(xiàn)的骨吸收增強最先由IL - 6啟動［6］。IL -6作為分化誘導因子,使骨髓細胞分化誘導單核、巨噬細胞、并促進巨噬細胞產(chǎn)生IL - 6,從而加速破骨細胞形成。本研究中發(fā)現(xiàn), 杜仲葉醇提物組IL-6水平明顯低于模型對照組(P<0.05)，提示杜仲葉醇提物對IL-6有抑制作用,進而抑制骨吸收。 【參考文獻】 �。�2］Task Force. Postmenopausal estrogen replacement and risk forvenous thromboembolism: a systematic review and meta - analysis for the U. S［J］. Preventive Services Ann Intern Med，2002, 136 (9) : 42. �。�3］馬中書，王蕊，邱明才，等. 單劑補腎中藥防治去卵巢大鼠骨質疏松的骨形態(tài)計量學研究［J］. 天津醫(yī)藥，1999,27（3）：131-134. �。�4］Bain SD , Bailey MC , Celino DL. High-dose estrogen inhibits bone resorption and stimulates bone formation in ovariectomized mouse［J］.J Bone Miner Res , 1993 ,8 (4) :435-442. �。�5］Chow J , Tobias JH , Colston KW. Estrogen maintains trabecular bone volume in rats not only by suppression of bone resorption but also by stimulation of bone formation［J］.J Clin In , 1992 ,89 (1) :74. �。�6］周丕琪,沈霖,杜靖遠,等. 絕經(jīng)后骨質疏松癥與血清IL -6、TNF -α濃度關系的臨床研究［J］.中國骨質疏松雜志, 2001, 7 (1) : 1-4.
綠原酸Chlorogenic acid327-97-9 綠原酸（氯原酸,咖啡鞣酸）對照品 綠原酸98%,30%,25% 杜仲提取物Eucommia Ulmoides P.E. 熊果酸Ursolic acid 77-52-1 熊果酸對照品 熊果酸（烏索酸 烏蘇酸）98%,95%,90%,25%,10% 枇杷葉提取物Loquat Leaf P.E 金銀花提取物HoneySuchle Flowers Extract 綠原酸（氯原酸,咖啡鞣酸）Chlorogenic acid 327-97-9綠原酸98%,6%,5% 淫羊藿提取物 Epemidium Extract 淫羊藿甙、淫羊藿甙Icariin 489-32-7 淫羊藿甙60-98% 淫羊藿甙對照品 大花紫薇提取物Banaba P.E 科羅索酸corosolic acid4547-24-4 科羅索酸對照品 科羅索酸1-98% 苦杏仁提取物Bitter Apricot Seed P.E 苦杏仁苷 苦杏仁甙 Amygdalin29883-15-6 苦杏仁甙98%HPLC 大黃素（朱砂蓮甲素）Emodin 大黃提取物 大黃素5-98% 藤茶提取物Ampelopsis grossedentataP.E 二氫楊梅素（雙氫楊梅素 二氫楊梅樹皮素）Dihydromyricetin 27200-12-0 楊梅素 楊梅樹皮素Myricetin 楊梅樹皮提取物529-44-2 丹參提取物Salvia root P.E 丹參酮IIA Tanshinone ⅡA568-72- 9 98% HPLC 隱丹參酮 327-97-9;77-52-1;489-32-7;4547-24-4;29883-15-6;528-82-1;27200-12-0;529-44-2;529-44-2;528-43-8;35354-74-6 528-43-8 35354-74-6 長沙上禾生物科技有限公司 24小時客戶熱線：13875855783 網(wǎng)站：www.csnutilities.com 電話：86-0731-84213302 18975172140 MSN:jiehua0501@hotmail.com E-MAIL: jiehua0501@gmail.com staherb@staherb.com 地址：長沙麓谷高新技術開發(fā)區(qū) 上禾生物科技---專注植提，精于高純，基于您對天然產(chǎn)物需求持續(xù)創(chuàng)新 |
