厚樸提取物厚樸酚對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與γ-氨基丁酸的關(guān)系 | 厚樸提取物厚樸酚對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與γ-氨基丁酸的關(guān)系 |
| 發(fā)布時(shí)間:2011-12-26 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):2720 |
作者：劉可云，黃賢珍 1.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000； 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 ，貴州 遵義 563003 【關(guān)鍵詞】 厚樸提取物 厚樸酚；,,腦缺血再灌注；,,γ-氨基丁酸；,,谷氨酸 和厚樸酚 厚樸總酚 摘要：目的研究厚樸酚對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與γ氨基丁酸（GABA）的關(guān)系。方法采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，用高效液相熒光法測定大鼠腦組織谷氨酸（GLU）和GABA的含量。結(jié)果厚樸酚可以明顯降低腦缺血再灌注后GLU含量，增加GABA的含量。結(jié)論 厚樸酚對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用，該作用與其提高抑制性氨基酸GABA的含量，產(chǎn)生抑制性保護(hù)作用有關(guān)。 關(guān)鍵詞：厚樸酚； 腦缺血再灌注； γ-氨基丁酸； 谷氨酸 和厚樸酚 厚樸總酚 Neuroprotective Effect of Magnolol against Focal Cerebral Ischemia-reperfusion Injury and the Relation to GABA in Rats (1．Department of Pharmacology, School of Medicine, Hubei College for Nationalities, Enshi 445000, China; 2. The Affiliated Hospital,Zunyi Medical College,Zunyi 563003, China) Abstract：Objective To study the protective effect of magnolol against focal cerebral ischemia-reperfusion injury and the relation to gamma- aminobutyric acid （GABA）in rats. MethodsThe middle cerebral artery occlusion(MCAO) model in rats was established to investigate the role of magnolol. The levels of glutamate (GLU) and GABA in cerebral tissue were measured by high performance liquid chromatography-fluorometer (HPCLFR) method. ResultsThe levels of GLU markedly decreased while the levels of GABA obviously increased by magnolol in MCAO rats.ConclusionMagnolol could prevent MCAO rats from ischemia-reperfusion injury, the pretective effect is related to magnolol keeping dynamic balance of excition-inhibition ,and persisting inhibitiondepended effect. Key words：Magnolol; Cerebral ischemia-reperfusion injury; Gama-aminobutyric acid; Glutamate 1 材料與方法 1.1 主要藥品和試劑厚樸酚由重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供，純度>90％。甲醇(色譜醇)購自上海凌峰化學(xué)試劑廠。谷氨酸 (GLU)和GABA標(biāo)準(zhǔn)品購自上海試劑三廠。 1.2 主要儀器美國惠普公司HP1050型高效液相色譜儀。德國BeckmanJ221型高速離心機(jī)。 1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法40只健康清潔級(jí)Wistar大鼠，體重為（300±20）g，雌雄不限，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注模型組、小劑量厚樸酚預(yù)處理組、大劑量厚樸酚預(yù)處理組，每組10只。其中厚樸酚預(yù)處理組于實(shí)驗(yàn)前3 d開始灌胃給藥，給藥劑量分別為25 mg/kg和75 mg/kg。 1.4 大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型的制作 參照Longa等［5］的線栓法，用10％水合氯醛(4 ml ?kg1，ip)麻醉大鼠，將麻醉后的大鼠仰臥位固定，消毒皮膚，鋪無菌孔巾，頸正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈，頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈分叉切口處向頸內(nèi)動(dòng)脈插入栓線約(18.5±0.5) mm，感覺有阻力即達(dá)大腦中脈起始部，完全阻斷其血流，結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈。2 h后拔出栓線，再灌注24 h，即造成缺血再灌注模型。所用栓線為直徑0.2 mm尼龍漁線，頭段燒圓，頂端直徑約0.25~0.28 mm。術(shù)中室溫在（27±0.5）℃。術(shù)后縫合傷口，動(dòng)物回籠。術(shù)中保持肛溫恒定。動(dòng)物清醒后出現(xiàn)以左前肢偏癱為主的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)為模型成功的標(biāo)志。凡呼吸困難、術(shù)中出血量較大、術(shù)后30 min仍未蘇醒者均棄之不用。假手術(shù)組除了不插栓線外，其余步驟同手術(shù)組。 1.5 標(biāo)本處理全部大鼠剪斷頭部，迅速取腦，在冰盤上分離缺血側(cè)腦組織，電子天平準(zhǔn)確稱重，即刻凍存在-20℃冰箱。取腦組織于勻漿器內(nèi)用甲醇反復(fù)充分溶漿3次，轉(zhuǎn)移合并提取液至離心管內(nèi)，置超聲波上處理30 min，10 000 r?min1，10℃以下冷凍離心30 min，將上清液轉(zhuǎn)入液閃瓶內(nèi)，80℃水浴使甲醇蒸發(fā)干,瓶內(nèi)準(zhǔn)確加入1.35 ml 0.1mol?L1的HC1，再超聲處理30 min，使氨基酸充分溶出。將溶出物再次冷凍離心30 min，取上清液用于氨基酸分析。 1.6 氨基酸分析 色譜條件：HP Hypersil ODS (4 mm×125 mm)5μm ，流動(dòng)相A：8.0 mmol?L1磷酸緩沖液(pH 7.2)，流動(dòng)相B：8.0 mmol?L1 磷酸緩沖液(pH7.2)+甲醇+乙腈(50+35+15)，流量1.0 ml?min1，柱前自動(dòng)衍生程序：設(shè)置自動(dòng)進(jìn)樣程序?yàn)橐来挝?μl OPA試劑，5μl 0.1 mol?L1，pH 10.4硼酸緩沖液和1 μl樣品，梯度洗脫程序：0 min，0％B；25 min，100％ B；35 min，100％ B；35 min，100％ A；45min，100％A。檢測程序：熒光檢測器波長Ex=340 nm，Em =450 nm。 1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 ±s表示，不同組間比較采用方差分析，兩樣本間比較采用Q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。 2 結(jié)果 腦缺血2 h再灌注24 h后，與假手術(shù)組比較腦組織GLU顯著升高(P<0.01)，GABA顯著降低（P<0.01）。厚樸酚組與模型組比較GABA均顯著性升高(P<0.01)，大劑量厚樸酚組與模型組比較GLU顯著性降低(P<0.01)，但小劑量厚樸酚組與模型組比較降低沒有顯著性(P>0.05)。結(jié)果見表1。表1 厚樸酚對(duì)腦缺血再灌注后腦組織GLU 和GABA含量的影響 (略) 3 討論 腦缺血后興奮性氨基酸(EAA)過量釋放，產(chǎn)生興奮性毒性。GLU是最主要的中樞興奮性氨基酸遞質(zhì)，具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性。GABA是腦內(nèi)主要的抑制性氨基酸遞質(zhì)，由GLU脫羧而成，其主要生理功能是與受體結(jié)合后使神經(jīng)元產(chǎn)生突觸前或突觸后抑制。許多研究認(rèn)為，再灌注后興奮性氨基酸大量釋放，作用于突觸后神經(jīng)元．產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒作用，導(dǎo)致突觸后神經(jīng)元損害［6］。有研究發(fā)現(xiàn)在缺血早期EAA大量釋放的同時(shí)，腦內(nèi)GABA的釋放也相應(yīng)增加，在后期腦內(nèi)GABA含量降低。缺血早期GABA大量釋放，可能是由于在正常情況下神經(jīng)遞質(zhì)水平受一個(gè)耗能的、內(nèi)流――外流循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)所控制，缺血時(shí)由于能量衰竭轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)受抑制，因此去極化導(dǎo)致的遞質(zhì)外流和重?cái)z取抑制是GABA升高的主要原因［7］。近年來大量研究表明GABA對(duì)腦缺血有保護(hù)作用，在腦缺血再灌注后GABA降低可能加重腦損傷［1~8］。另有報(bào)道，GABA及其擬似劑可以治療腦缺血后因興奮性氨基酸大量釋放引起大的神經(jīng)損傷［2］。采用生物鑒定法，在可逆性MCAO缺血模型上的研究發(fā)現(xiàn)，缺血5 min后腹腔注射GABAB激動(dòng)劑baclofen 20 mg／kg具有神經(jīng)保護(hù)作用［9］。 厚樸酚是傳統(tǒng)中藥厚樸的主要成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、拮抗鈣調(diào)素、神經(jīng)保護(hù)作用等多種藥理作用�，F(xiàn)已證明，以鼠胚脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元原代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，�?shí)驗(yàn)組分別加入單味中藥提取物，用MTT法觀察其對(duì)細(xì)胞活力的影響。發(fā)現(xiàn)厚樸對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有保護(hù)作用。對(duì)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)可能有促進(jìn)作用［10］。也有研究表明厚樸酚能通過抗氧化作用降低腦缺血/再灌注神經(jīng)元損傷［3］。近來研究發(fā)現(xiàn)厚樸酚與和厚樸酚對(duì)GABAA受體具有選擇性激動(dòng)作用［4］。 本實(shí)驗(yàn)研究顯示，腦缺血2 h再灌注24 h后腦組織GLU大量釋放，而GABA明顯下降。厚樸酚預(yù)處理可以降低GLU釋放，增加GABA水平，對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。 厚樸酚可以改善腦缺血再灌注損傷引起的GLU升高、GABA降低而產(chǎn)生保護(hù)作用，可能與下列中樞作用有關(guān)：①作為GABA受體的激動(dòng)劑與受體結(jié)合而發(fā)揮GABA的作用；②對(duì)谷氨酸脫羧酶有促進(jìn)作用，增加GABA的合成和釋放，抑制GABA轉(zhuǎn)氨酶，減少GABA的代謝最終增加腦內(nèi)GABA水平，而對(duì)腦缺血產(chǎn)生抑制性保護(hù)作用。但是這些假說還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。 參考文獻(xiàn)： ［1］Schwartz-Bloom RD,Sah R.gamma- aminobutyric acid(A)-neuro-transmission and cerebral ischemia［J］. Neurochem, 2001，77(2):353. �。�2］Nelon RM,Hainsworth AH,Lambert DG, et al. Neuroprotective efficacy of AR-A008055,a clomethiazole analogue,in a global model of acute ischemia stroke and its effert on ischemia-induced glutamate and GABA efflux in vitro［J］.Neuropharmacology,2001，41（2）：159. �。�3］Zhang Guang-Qin，Chen Shi-Zhong，Hao xue-Mei,et al.The protective of magnolol on cerebral ischemia［J］. Chinese pharmacological bulletin， 2003， 19(9): 1020. �。�4］Ai,-J; Wang,-X; Nielsen,-M. Honokiol and magnolol selectively interact with GABAA receptor subtypes in vitro［J］. Pharmacology，2001，63(1): 34. �。�5］Longa EZ，Philip MD．Reversible middle cerebralartery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1)：84. �。�6］張 萍．谷氨酸及其受體變化與神經(jīng)細(xì)胞損害［J］.國外醫(yī)學(xué)?神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科分冊，1995，22(4)：182． ［7］Shuaib A, Ijaz MS, Miyashita H, et al. GABA and glutamate levels in substantia nigral reticulation following repeatitive cerebral ischemia in gerbils［J］.Exp Neurol,1997，147(2):311. �。�8］Green AR, Hainsworth AH, Jackson DN, et al.GABA protentiation：A logical approach for the treatment of acute ischemia stroke［J］. Neuropharmacology，2000，39(9):1483. �。�9］Friedman CJ，Lyden PD．Nanez S， et a1．High dose baclofen is neuroprotective but also causes intracerebral hemorrhage：a quantal bioassay study using the intraluminal suture occulsion method［J］.Exp Neurol，1997，147：346． �。�10］張艷軍. 增強(qiáng)原代培養(yǎng)鼠胚脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元活力的中藥篩選［J］.天津中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，23(2):75. |
