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作者：周 芳，曾憲利，彭 抿

作者單位：410016 湖南長沙，湖南旺旺醫(yī)院眼科中心

【摘要】 目的 研究苦杏仁甙(Amygdalin)對(duì)體外培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細(xì)胞增生的影響。方法 取第2代對(duì)數(shù)生長期的兔晶狀體上皮細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的苦杏仁甙(4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125mg/L)作用24h后，采用MTT法觀察苦杏仁甙對(duì)兔晶狀體上皮細(xì)胞增生的影響。結(jié)果 苦杏仁甙隨著濃度的增加，兔晶狀體上皮細(xì)胞增生的抑制作用逐漸增強(qiáng)。結(jié)論 苦杏仁甙能有效抑制體外培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細(xì)胞增生，其抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)有劑量依賴性。

【關(guān)鍵詞】 苦杏仁甙;兔晶狀體上皮細(xì)胞;后囊渾濁;MTT比色法  苦杏仁苷 苦杏仁提取物  上禾生物苦杏仁提取物

The effects of Amygdalin on proliferation of lens epithelial cells in vitro

ZHOU Fan，ZENG Xian�瞝i，PENG Min.Eye Center of Wangwang Hospital in Hunan,Changsha 410016,China

[Abstract] Objective To study the effects of Amygdalin on the proliferation of rabbit lens epithelial cells(RLECs)in vitro.Methods RLECs were primary cultured.After the second generation of RLECs were incubated for 24 hours，we added different concentraions of Amygdalin for 24 hours.The cell proliferation of RLECs was determined by MTT assay.Results The inhibitory rates of RLECs proliferation were increased in dose.dependent ways by Amygdalin in vitro.Conclusion Amygdalin could effectively inhibit the proliferation of RLECs，and it might have broad prospects in the prevention of posterior capsular opacification.

[Key words] amygdalin;rabbit lens epithelial cells;posterior apsular opacification;MTT assay

后囊渾濁(posterior capsular opacification，PCO)是現(xiàn)代白內(nèi)障囊外摘出人工晶狀體植入術(shù)后最常見的并發(fā)癥。后囊混濁的發(fā)生主要由于術(shù)后殘留的晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial　cells，LECs)發(fā)生增生及后囊的纖維化有關(guān)。其發(fā)生率往往與年齡相關(guān)，年齡越輕，發(fā)生率越高。在成人，術(shù)后發(fā)生率為30%～50%，在兒童則為100%。因此，如何有效地抑制晶狀體上皮細(xì)胞增生對(duì)于PCO的防治具有重要意義�？嘈尤蔬�(Amygdalin)是中藥桃仁的主要成分，是一種能生氰(cyanogensic)的化合物。存在于水果果核和堅(jiān)果中。有研究表明它能有效抑制纖維母細(xì)胞增生[1]，而且可以明顯地抑制組織的纖維化[2]。這里我們采用MTT比色法研究其對(duì)體外培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細(xì)胞(rabbit lens epithelial cells，RLECs)增生的影響，為進(jìn)一步探索其作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器 主要試劑苦參堿;胰蛋白酶、小牛血清、DMEM干粉培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)、二甲基亞砜。二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、超凈工作臺(tái)、自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀(E2500型，美國BioRad)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法 健康雄性新西蘭大白兔5只，體重1.4～1.6kg，以空氣栓塞法處死。立即取出眼球置于1∶8000的慶大霉素生理鹽水中，無菌手術(shù)臺(tái)上將其晶狀體取出。在手術(shù)顯微鏡下，剝離晶狀體囊膜，剪為大小約1mm2的小塊，均勻平貼于培養(yǎng)皿中，間隔3～5mm。放置2～3h待囊貼牢后后，加入含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基至剛好浸沒囊膜，置入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3～5天換液1次，待細(xì)胞長滿后，用0.25%胰蛋白酶消化。按1∶2的比例接種到培養(yǎng)瓶中。倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長情況，取第2代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞處理 取第2代RLECs，用胰酶消化并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μl。置入二氧化碳培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h靜待細(xì)胞貼壁;加入1g/L苦杏仁甙PBS溶液并調(diào)整濃度為4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125mg/L，空白對(duì)照組則加入等量的PBS溶液，培養(yǎng)24h后，每孔加入MTT(5mg/L)溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后中止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入150μl二甲基亞砜溶液，室溫下微量振蕩器振蕩10min，自動(dòng)酶標(biāo)儀比色(波長570nm)，測(cè)定吸光值。以此計(jì)算細(xì)胞存活率和細(xì)胞抑制率(細(xì)胞存活率%=藥物組平均吸光度值/正常對(duì)照組平均吸光度值×100%，細(xì)胞抑制率%=100%-細(xì)胞存活率)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究獲取的數(shù)據(jù)采用(±s)表示，用SPSS13.0進(jìn)行成組資料的方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)檢驗(yàn)顯著性水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的苦杏仁甙溶液對(duì)RLECs增殖的影響 見表1。表1 不同濃度的苦杏仁甙溶液對(duì)RLECs增殖的影響注：經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，對(duì)照組與各試驗(yàn)組比較差異有顯著性(P<0.05);各濃度組組間比較差異有顯著性(P<0.05)

2.2 不同濃度的苦杏仁甙溶液對(duì)RLECs增殖的影響 見圖1。我們MTT比色法檢測(cè)顯示，苦杏仁甙對(duì)體外培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細(xì)胞增生有抑制作用(表1、圖1)，在同樣處理24h的時(shí)間段內(nèi)，細(xì)胞的存活率隨苦杏仁甙濃度梯度的上升呈逐漸下降的趨勢(shì)，其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制能力也逐步增強(qiáng)。

圖1 不同濃度苦杏仁甙溶液對(duì)RLECS增殖的影響

3 討論

目前，對(duì)于晶狀體手術(shù)后晶狀體后囊渾濁的抑制研究已經(jīng)非常深入。其發(fā)生機(jī)制與手術(shù)刺激、殘存的晶狀體上皮細(xì)胞的特性、眼房水屏障的破壞及多種細(xì)胞因子的作用等有關(guān)。人們有針對(duì)性地對(duì)后囊混濁的特點(diǎn)進(jìn)行多種思路的抑制研究，應(yīng)用抗代謝藥物，如5�睩U、秋水仙堿、甲氨蝶呤、柔紅霉素、絲裂霉素等。這些藥物的毒副作用較大，對(duì)眼內(nèi)組織的影響較大，目前還沒有較好的解決方案，限制其臨床應(yīng)用。

苦杏仁甙屬于芳香族氰甙，存在于多種植物的種子中，其抗腫瘤、抗纖維化及抗氧化作用已經(jīng)得到多方的證實(shí)，有研究表明，它可以有效抑制人胎腎成纖維細(xì)胞的增殖，并可以誘導(dǎo)其凋亡[3]。我國洪長福等研究證實(shí)其能有效地延緩肺纖維化的形成[4]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)苦杏仁甙對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的增生有明顯的抑制作用，并具有良好的劑量依賴性，對(duì)晶狀體上細(xì)胞的抑制效果相當(dāng)?shù)拿黠@�？嘈尤蔬胺肿咏Y(jié)構(gòu)含有兩個(gè)分子的葡萄糖，一個(gè)分子的氰氫酸和一分子的苯甲醛。在體內(nèi)苦杏仁甙被β�蔡擒彰�(Glucosidase)作用分解成其組成成分，釋放出氰化物而發(fā)揮其抑制作用，氰化物本身具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能抑制線粒體的功能，使細(xì)胞窒息死亡，因此，作用較強(qiáng)。由于體內(nèi)還有種酶叫硫氰酸酶(rhodanase)。硫氰酸酶可以將游離的氰化物變成無毒的硫氰酸化合物，其應(yīng)用有較高的安全性。因此，我們認(rèn)為苦杏仁甙在防治后囊渾濁方面具有一定的應(yīng)用前景。但其安全使用的方法是浸泡即將植入的人工晶體還是按一定比例加入白內(nèi)障手術(shù)的灌注液中，仍需進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

1 宋月蓮，鄭應(yīng)昭，李素慧.中藥桃仁對(duì)體外纖維母細(xì)胞增生的抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.中西醫(yī)結(jié)合眼科雜志，1995,1：1��3.

2 郭君其，盛明雄，譚建明，等.苦杏仁甙抑制大鼠腎臟纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2007，23(17)：2628��2630.

3 屈燧林，方勤，陳高翔，等.漢防己甲素、川芎嗪和苦杏仁甙對(duì)人腎成纖維細(xì)胞的影響.中華腎臟病雜志，2000，16(3)：18��20.

4 洪長福，婁金平，周華仕，等.桃仁提取物對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性矽肺纖維化的影響.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，11(1)：7��11.

MTT比色法檢測(cè)苦杏仁甙對(duì)兔晶狀體上皮細(xì)胞增生的影響

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