作者：潘曌曌,王雪峰,閆麗娟,南春紅,岳志軍 作者單位：1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧 沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,遼寧 沈陽 110032 國家教育部博士點(diǎn)基金課題(20040162004)
【摘要】 目的 觀察金銀花提取物體外抑制甲型流感病毒FM1株的作用。方法 采用血凝試驗(yàn)方法,測定不同濃度金銀花提取物體外和雞胚內(nèi)抑制流感病毒效價,分析金銀花提取物對病毒增殖的影響。結(jié)果 與病毒對照組比較,金銀花提取物組血凝效價降低,其抑制作用時間可從1 h持續(xù)到24 h,其對病毒的抑制作用隨著藥物濃度的降低而逐漸減弱；金銀花提取物在100、50、25 mg/mL時,對感染流感病毒雞胚具有預(yù)防和保護(hù)治療作用(P<0.001),而在100 mg/mL時的預(yù)防作用明顯優(yōu)于陽性對照病毒唑組(P<0.05)。結(jié)論 金銀花提取物可有效抑制甲型流感病毒FM1株。
【關(guān)鍵詞】 甲型流感病毒；金銀花提取物；綠原酸；雞胚 金銀花綠原酸 上禾生物綠原酸 上禾生物金銀花提取物
Inhibitory Effect of Extracts from Flos Lonicerae on Influenza A Virus FM1 Strain in Vitro
PAN Zhao-zhao, WANG Xue-feng, YAN Li-juan, et al
1. Liaoning University of TCM, Shenyang 110032, China；2.The Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM, Shenyang 110032, China
Abstract：Objective To observe the effect of extracts from Flos Lonicerae inhibiting influenza A virus FM1 strain. Method Use the method of hemagglutination test, determine the hemagglutination inhibition titer that extracts from Flos Lonicerae inhibiting influenza A virus in vitro and in embryonated egg. Result Compared with the control group, the hemagglutination inhibition titer of extracts from Flos Lonicerae group were degraded. The depressant effect kept on from 1 hour to 24 hour, and the depressant effect were degraded with the stepping down of the concentration. At the concentration of 100, 50, 25 mg/mL, extracts from Flos Lonicerae had the preventative effect and therapeutical effect on embryonated egg infected by influenza A virus (P<0.001). At the concentration of 100 mg/mL, the preventative effect of extracts from Flos Lonicerae group was better than Ribavirin group (P<0.05). Conclusion Extracts from Flos Lonicerae can suppress influenza A virus FM1 strain actively.
Key words：influenza A virus；extracts from Flos Lonicerae；Chlorogenic Acid；embryonated egg
本實(shí)驗(yàn)對金銀花體外抗流感病毒作用進(jìn)行系列研究,旨在闡明該藥在中藥復(fù)方銀翹散中抗流感病毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ),為將該藥及其有關(guān)復(fù)方研制成治療病毒性呼吸道疾病的現(xiàn)代(復(fù)方)中藥奠定基礎(chǔ)。
1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 藥物及主要試劑
金銀花飲片購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院門診藥局,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥分析教研室張振秋教授鑒定為忍冬科植物忍冬的花蕾金銀花。利巴韋林注射液(江蘇吳中實(shí)業(yè)股份有限公司,批號060208)；綠原酸對照品(自配,濃度0.111 2 mg/mL)。
1.2 病毒
甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/FM1/47(H1N1),中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供,凍存于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)病毒室,經(jīng)鼠肺、雞胚傳代后為FM1M9E2M1E3M2E4M1E5。
1.3 雞胚
9日齡尼克白種雞胚,SPF級,購于遼寧省益康生物制品廠。
1.4 1%雞紅細(xì)胞懸液
采集健康公雞血,阿氏液抗凝,生理鹽水1 500 r/min離心洗滌3次,棄上清,以無菌生理鹽水配制成1%懸液,4 ℃冷藏備用[1]。
1.5 主要儀器
Ⅱ級生物安全柜(美國Baker公司,型號：SG403TXCE)；高效液相色譜儀(日本島津SPD-10AVP)；N-2000雙通道色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息工作研究所)；低溫高速離心機(jī)(德國Heraeus,型號：Biofuge 28RS)；臺式壓力蒸汽滅菌器(沈陽盛達(dá)生物電子設(shè)備有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；AS3120電子超聲儀。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 金銀花提取物的制備及其鑒定
2.1.1 藥物提取
電子天平稱量金銀花飲片放入圓底燒瓶中,加入配制好的80%乙醇14倍量,電熱套加熱回流2 h；第1次提取后傾倒濾液,藥渣再加80%乙醇10倍量,加熱回流1 h；合并濾液,加熱濃縮,水浴箱通風(fēng)櫥加熱揮發(fā)成膏狀,置于電熱烘箱內(nèi)烘干,研成粉末避光冷藏備用。用于體外實(shí)驗(yàn)時,用生理鹽水配成濃度為400 mg/mL的溶液,高速離心機(jī)4 000 r/min離心30 min,取上清,高溫高壓滅菌后4 ℃冷藏備用。
2.1.2 供試品溶液的制備
精稱樣品粉末0.1751 g,置錐形瓶中,加50%甲醇50 mL定容,超聲30 min；放冷,過濾,取續(xù)濾液5 mL,入棕色量瓶保存待測,檢測時用0.45 μm微孔濾膜過濾。
2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及樣品的測定
吸取對照品溶液5 μL注入液相色譜儀,以乙腈-0.4%磷酸(13∶87)為流動相,柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL/min,于327 nm波長處檢測；以綠原酸峰面積為縱坐標(biāo),綠原酸量(μg)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程。并在上述色譜條件下測定對照品溶液及供試品溶液的峰面積。
2.2 流感病毒增毒及其在雞胚上半數(shù)感染量的測定
將病毒原液接種于局部消毒后的9日齡SPF雞胚尿囊腔,每胚接種0.1 mL,石蠟封口,33～35 ℃溫箱孵育48 h,4 ℃過夜。收取尿囊液,紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)測血凝滴度。
將流感病毒原液系列對數(shù)稀釋(10-1～10-12),分別接種在事先標(biāo)記好的雞胚尿囊腔內(nèi),每個濃度接種4個雞胚,并做生理鹽水對照。將注射了流感病毒的雞胚放入33～35 ℃溫箱內(nèi),48 h后取出,放入4 ℃冰箱內(nèi)過夜；收取尿囊液,每胚0.1 mL依次加入作好標(biāo)記的血凝板上,再加入預(yù)先配制好1%的雞血球0.1 mL,輕搖后40 min觀察結(jié)果,用k·rber公式[2]計(jì)算。測得EID50為10-6.28,實(shí)驗(yàn)用100EID50。
2.3 金銀花提取物最大不凝血濃度的測定
中藥中含有植物血凝素,在體外實(shí)驗(yàn)中往往引起紅細(xì)胞凝集,造成假陽性結(jié)果。因此,應(yīng)用血凝試驗(yàn)探討中藥體外抑制病毒作用,必須測定中藥的最大不凝血濃度以去除影響因素。處理好的藥液從原濃度始,用pH值7.4的Hank,s工作液2倍系列稀釋6個濃度：2-1～2-6(400～12.5 mg/mL),分別加入等量固定血凝單位的流感病毒,33～35 ℃溫箱中和2 h,測定血凝效價,同時設(shè)Hank,s液對照和病毒對照。結(jié)果測得金銀花提取物不引起血凝的最大濃度為25 mg/mL。
2.4 金銀花提取物及利巴韋林注射液對雞胚最大無毒濃度的測定
用含PS 10%的生理鹽水將藥物原液作連續(xù)2倍系列稀釋至1∶512濃度,每次抽取0.2 mL分別接種在預(yù)先作好標(biāo)記的雞胚上,每個濃度接種4個雞胚,并設(shè)生理鹽水對照。將接種好的雞胚放入35 ℃溫箱內(nèi)孵育48 h,每12 h觀察記錄雞胚存活情況,24 h內(nèi)死亡的雞胚不記入藥物毒性作用致死數(shù)。金銀花提取物的最大無毒濃度為100 mg/mL,利巴韋林注射液最大無毒濃度為50 mg/mL。
2.5 金銀花提取物不同濃度、不同時間體外抑制病毒作用
用pH 為7.4的Hank,s工作液,將金銀花提取物溶液從最大不凝血濃度起作系列2倍稀釋3個濃度,每個濃度4支試管,分別加入等量100EID50的流感病毒,置33～35 ℃溫箱中和1、4、8、14、16、24 h,測各組藥物不同濃度、不同時間點(diǎn)血凝效價,同時設(shè)病毒對照和Hank,s液對照。
2.6 金銀花提取物對甲型流感病毒感染雞胚預(yù)防和保護(hù)作用
2.6.1 預(yù)防作用
藥物原液自TD0開始2倍比稀釋3個濃度(100、50、25 mg/mL),每胚0.1 mL分別接種雞胚,每個濃度8個雞胚,37 ℃孵育2 h,并設(shè)生理鹽水和病毒對照；然后分別接種0.1 mL的100EID50的病毒懸液,放入35 ℃溫箱內(nèi)48 h,再4 ℃過夜。抽取尿囊液,測定血凝滴度。
2.6.2 治療作用
用100EID50病毒懸液接種雞胚,34 ℃孵育2 h,再分別接種與預(yù)防實(shí)驗(yàn)同濃度的藥液,每組8個雞胚,并設(shè)生理鹽水及病毒對照。34 ℃溫箱內(nèi)48 h,再4 ℃過夜。抽取尿囊液,測定血凝滴度。
3 結(jié)果
(見圖1,表1～表3)表1 金銀花提取物體外直接抑制流感病毒作用(略)表2 不同濃度金銀花提取物對流感病毒感染雞胚預(yù)防作用(略)注：與病毒對照組比較,**P<0.001；與病毒唑組比較,#P<0.05（下同）。表3 不同濃度金銀花提取物對流感病毒感染雞胚治療作用(略)
在供試樣品溶液色譜圖中,與對照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上,有一相同保留時間的色譜峰,經(jīng)計(jì)算金銀花提取物樣品中綠原酸含量為1.76%。
4 討論
我們的前期實(shí)驗(yàn)得出銀翹散全方、君藥組和臣藥組均具有抑制流感病毒在小鼠體內(nèi)增殖、保護(hù)肺組織的作用。單味藥金銀花提取物抗甲型流感病毒FM1株的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該藥具有很強(qiáng)的直接殺滅甲型流感病毒FM1株的作用,并且對流感病毒的預(yù)防及治療作用效果顯著。
綠原酸是金銀花的主要藥用成分,具有顯著的清熱解毒和抗菌消炎作用,國家藥典也以綠原酸為指標(biāo)控制含量。本實(shí)驗(yàn)采用80%乙醇回流提取方法,去除部分雜質(zhì),得到金銀花粗提物,并通過樣品含量計(jì)算,得到金銀花抗流感病毒有效部位中綠原酸含量為1.76%,達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。因此可以推論,綠原酸可能是中藥金銀花抗流感病毒作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 馬丙祥,段曉穎,王志超,等.雙花噴霧劑治療小兒上呼吸道感染臨床與實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2000,20(9)：655.
[2] 郭元吉.流行性感冒病毒及實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國三峽出版社, 1997.120.
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