杜仲不同提取物對帕金森病小鼠的治療作用及譜效關(guān)系研究 | 杜仲不同提取物對帕金森病小鼠的治療作用及譜效關(guān)系研究 |
| 發(fā)布時間:2022-06-06 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):485 |
摘 要：目的 探究杜仲不同提取物對帕金森病小鼠的治療作用及其超高效液相色譜（UPLC）分析與治療帕金森病的譜效關(guān)系。方法 通過小鼠爬桿實驗、腦內(nèi)紋狀體多巴胺（DA）含量，觀察杜仲不同梯度的乙醇提取物對帕金森病小鼠的治療作用；采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）對杜仲不同提取物進(jìn)行分析；結(jié)合爬桿實驗及DA水平結(jié)果，采用偏最小二乘法回歸（PLSR）分析建立其譜效關(guān)系，明確杜仲治療帕金森病的藥效成分。結(jié)果 杜仲50%、75%乙醇提取物均能明顯縮短小鼠爬桿時間；杜仲75%乙醇提取物能顯著增加小鼠腦內(nèi)紋狀體DA水平；PLSR分析結(jié)果顯示，杜仲中杜仲醇苷、鵝掌楸苷、5-羥甲基糠醛、咖啡酸與爬桿實驗結(jié)果和紋狀體多巴胺含量密切相關(guān)。結(jié)論 杜仲乙醇提取物具有抗帕金森病作用，其中75%乙醇提取物效果最顯著；杜仲醇苷、鵝掌楸苷、5-羥甲基糠醛、咖啡酸可能是杜仲治療帕金森病的主要有效成分。
杜仲為杜仲科（Eucommiaceae）杜仲屬Eucommia Oliver植物杜仲E. ulmoides Oliv. 的干燥樹皮，是我國名貴的滋補藥材。杜仲性溫，味甘，歸肝、腎經(jīng)，具有補肝腎、強筋骨、安胎的功效[1]�，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，杜仲主要成分為木脂素類、多糖類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、氨基酸類等，其主要有增強免疫力、抗癌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗肝纖維化、抗炎等藥理作用[2]。帕金森�。�Parkinson’s disease，PD）是一種常見的漸進(jìn)性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，發(fā)病機(jī)制主要為多巴胺（DA）能神經(jīng)元退行性死亡，臨床表現(xiàn)主要為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直、姿勢步態(tài)不穩(wěn)等運動癥狀及情緒障礙、睡眠障礙、感覺障礙、自主神經(jīng)功能障礙等非運動癥狀[3-4]。 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）是建立PD模型的常用藥物，能夠直接損傷小鼠腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元，減少多巴胺的產(chǎn)生，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)PD癥狀[5]。爬桿實驗是常用的衡量PD動物模型運動狀況的行為學(xué)指標(biāo)[6-7]。近年來，中藥譜效關(guān)系在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)方面的研究應(yīng)用越來越廣泛[8]，而杜仲改善PD癥狀的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少。本實驗采用不同梯度的杜仲乙醇提取物ig給予MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠，檢測其行為學(xué)指標(biāo)爬桿時間和腦內(nèi)紋狀體DA水平，以考察杜仲對PD的治療作用。同時采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)對杜仲不同提取物進(jìn)行分析，并將分析結(jié)果與爬桿時間和DA含量相結(jié)合，分別進(jìn)行偏最小二乘回歸法（PLSR）分析，闡述UPLC特征峰與抗PD作用的相關(guān)性，綜合分析2組譜效關(guān)系得出的結(jié)果，找出與治療PD密切相關(guān)的有效成分，為深入研究杜仲治療PD作用及闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。 1 材料 1.1 藥物及試劑 杜仲藥材購于河北省安國藥材批發(fā)市場，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定為杜仲科杜仲屬植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv. 的干燥樹皮。 無水乙醇購自天津市康科德科技有限公司； MPTP（批號SLBS6630，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、鹽酸DA（批號606A023，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）均購自美國Sigma公司；熊果酸（批號1213A025，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、京尼平（批號117B021，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自北京索萊寶科技公司。高氯酸（批號201201）購自天津市鑫源化工有限公司。 1.2 動物 清潔級雄性C57BL/6J小鼠，60只，體質(zhì)量19～23 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格證號SCXK（京）2014-0004。 1.3 儀器 高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent公司，美國）；電化學(xué)檢測器（Antec Leyden公司，荷蘭）；Waters反相C18色譜柱、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters公司，美國）；萬分之一天平（上海贊維衡器有限公司）。 2 方法 2.1 杜仲提取物的制備 分別稱取50 g杜仲至1 L圓底燒瓶中，分別加入10倍量即500 mL純水及25%、50%、75%、95%乙醇，回流提取2 h，抽濾，將藥渣按同樣方法加入8倍量溶劑，回流提取2 h，抽濾，2次提取的藥液合并旋蒸至50 mL，即制成含生藥1 g/mL的藥液。 2.2 PD模型的制備、分組及給藥 將60只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組、模型組、杜仲純水提取物組（純水組）及杜仲25%、50%、75%、95%乙醇提取物組（25%、50%、75%、95%乙醇組）。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，自由飲食飲水。對照組、模型組小鼠ig給予蒸餾水（0.01mL/g），純水組及25%、50%、75%、95%乙醇組分別ig給予相應(yīng)的藥液（0.01 mL/g），連續(xù)給藥3d。第4天開始，模型組、純水組和25%、50%、75%、95%乙醇組小鼠每天給藥1 h后ip給予MPTP（30 mg/kg），3～5 min后小鼠出現(xiàn)震顫、站立行走不穩(wěn)、毛發(fā)豎立等癥狀。對照組小鼠ip等劑量生理鹽水，連續(xù)5 d。 2.3 爬桿實驗 取1根長約60 cm，直徑約1 cm的豎桿，頂端固定直徑約2.5 cm的塑料小球，豎桿纏上紗布以防打滑。將小鼠頭部朝下置于頂端球上。記錄其開始向下爬行到雙后肢落地的時間，如小鼠中途停頓或反向爬行，則重新測量，超過60 s則記為60s。正式實驗前3 d每天進(jìn)行訓(xùn)練使小鼠適應(yīng)爬桿行為。末次給藥1 h后為正式實驗，重復(fù)3次，每次間隔5min。 2.4 小鼠腦內(nèi)紋狀體DA含量測定[9] 2.4.1 樣品制備 爬桿實驗結(jié)束后，將小鼠快速斷頭取腦，冰上剝離紋狀體，稱質(zhì)量，每毫克組織加10 μL 0.1 mol/L高氯酸溶液，勻漿，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清，置于冰上備用。 2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品DA 10 mg，分別置于10 mL量瓶中，加高氯酸定容至刻度，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液備用。 2.4.3 HPLC色譜條件 色譜柱：Waters反相C18色譜柱（150 mm×4.5 mm，5 μm）；流動相為19%甲醇-3%乙腈-78%水（含辛烷基11.56 mmol/L、NaH2PO4 100 mol/L、EDTA-2Na 0.095 mmol/L），pH 3.3～3.4；體積流量1 mL/min；柱壓1.35×104 kPa；進(jìn)樣體積10 μL。 2.5 杜仲不同提取物的UPLC-Q-TOF/MS分析 2.5.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC HSS T3 C18色譜柱（100 mm×2.1mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫程序見表1。柱溫40 ℃；體積流量0.3 mL/min；樣品室溫度4 ℃；進(jìn)樣體積5μL，進(jìn)樣時間33 min。
2.5.2 質(zhì)譜條件 運用四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析與鑒定。采用正、負(fù)離子模式，電噴霧離子源（ESI源）。毛細(xì)管電壓1.0 kV，脫溶劑溫度300 ℃，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣體積流量800 L/h，錐孔氣體積流量50 L/h。相對分子質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 200，數(shù)據(jù)采集采用MSE模式。 2.5.3 對照品溶液的制備 精密稱取對照品熊果酸、京尼平各1 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，過0.22 μm微孔濾膜，取濾液備用。 2.5.4 供試品溶液的制備 分別稱取杜仲5種不同提取液，用50%乙醇配制成質(zhì)量濃度為生藥20mg/mL的供試品溶液，超聲（功率100 W，頻率40 kHz）30min后過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。 2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。 3 結(jié)果 3.1 杜仲不同提取物對PD小鼠爬桿時間的影響 給藥結(jié)束后，模型組小鼠精神萎靡，行動遲緩，步態(tài)不穩(wěn)。與對照組比較，模型組小鼠爬桿時間顯著延長（P＜0.01）。與模型組比較，其他各給藥組小鼠爬桿時間縮短，其中，50%及75%乙醇組小鼠爬桿時間差異顯著（P＜0.05、0.01），見圖1。 3.2 杜仲不同提取物對PD小鼠腦紋狀體DA水平的影響 采用HPLC-ECD法檢測PD小鼠腦紋狀體組織DA水平。如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠紋狀體組織中DA量明顯降低（P＜0.01）；給予杜仲提取物后，75%乙醇組小鼠紋狀體組織中DA水平顯著升高（P＜0.05）。 3.3 杜仲不同提取物的UPLC-Q-TOF/MS分析 采用正、負(fù)離子模式采集杜仲不同提取物的質(zhì)譜信息。通過MassLynx 4.1工作站得到杜仲5種提取物的正、負(fù)離子模式UPLC疊加圖（圖3）。與對照品比對并結(jié)合文獻(xiàn)信息[10-20]，對UPLC分離出的50個主要特征峰進(jìn)行分析，鑒定出26個成分（表2）。 3.4 杜仲提取物UPLC圖譜與抗PD作用的PLSR分析 采用SIMCA-P 12.0數(shù)據(jù)處理軟件，將UPLC檢測出的50個化合物的相對含量（X）分別與爬桿時間（Y1）、DA水平（Y2）2個藥效指標(biāo)進(jìn)行PLSR分析，經(jīng)處理計算得到各變量標(biāo)準(zhǔn)化的回歸系數(shù)和變量重要性投影（VIP）值。 3.4.1 杜仲提取物UPLC-Q-TOF/MS分析結(jié)果與爬桿時間的相關(guān)性 杜仲提取物化合物分析結(jié)果與爬桿時間的PLSR回歸系數(shù)及VIP貢獻(xiàn)值見圖4。分析結(jié)果顯示杜仲提取物中的色譜峰有23個與爬桿時間呈正相關(guān)，其余27個峰與其呈負(fù)相關(guān)。一般而言，VIP值＞1，說明其對模型有顯著貢獻(xiàn)，對爬桿時間進(jìn)行PLSR分析，結(jié)果顯示峰26、48、45、44、13、5、31、10、4、19、23、22、35、36、9、49、47、30、3的VIP值＞1，說明在杜仲提取物的UPLC分析結(jié)果中，相對應(yīng)的成分對藥效指標(biāo)爬桿時間發(fā)揮著重要影響。 3.4.2 杜仲提取物UPLC-Q-TOF/MS分析結(jié)果與DA水平的相關(guān)性 杜仲提取物化合物分析結(jié)果與DA水平的PLSR回歸系數(shù)及VIP貢獻(xiàn)值見圖5。杜仲提取物中的色譜峰中有21個與DA水平呈正相關(guān)，其余29個峰與其呈負(fù)相關(guān)。同時對紋狀體DA水平也進(jìn)行PLSR分析，結(jié)果顯示峰45、44、48、22、7、26、24、41、33、5、29、31、23的VIP值＞1，說明在杜仲提取物的UPLC指紋圖譜中，相對應(yīng)的成分對藥效指標(biāo)紋狀體DA水平發(fā)揮著重要影響。 結(jié)合2個藥效指標(biāo)的PLSR分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)45、44、48、22、26、5、31、23號峰對爬桿時間和DA水平均發(fā)揮著重要的影響，其中5、22、23、26號峰經(jīng)鑒定分別為杜仲醇苷、鵝掌楸苷、5-羥甲基糠醛、咖啡酸。 4 討論 近年來，越來越多的研究表明杜仲及其化學(xué)成分具有神經(jīng)保護(hù)作用，不少治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床成方或經(jīng)方中均含有杜仲[21]，一些治療PD的方劑中也多以杜仲入藥[22-24]。但目前杜仲對于PD的治療還僅停留在臨床階段，少見實驗依據(jù)。本研究觀察了杜仲提取物對PD小鼠的治療作用。運動功能障礙是PD患者的主要臨床表現(xiàn)，爬桿實驗主要考察PD小鼠的肢體運動協(xié)調(diào)能力，可以作為金指標(biāo)反映藥物對PD的治療作用。PD主要病理改變是黑質(zhì)致密部DA神經(jīng)元嚴(yán)重缺失，紋狀體DA水平下降，導(dǎo)致肌肉運動障礙、運動震顫麻痹等，因此調(diào)節(jié)腦內(nèi)紋狀體DA水平亦是治療PD的關(guān)鍵。小鼠ip MPTP后出現(xiàn)靜止性震顫、運動協(xié)調(diào)能力下降、運動減少等PD癥狀，ig給予杜仲提取物后，其行為活動狀態(tài)有所改善。與模型組小鼠比較，杜仲給藥組小鼠爬桿時間、紋狀體DA水平亦明顯改善，證實杜仲對PD有治療作用。 本研究采用UPLC-Q-TOF/MS法分析并鑒定出杜仲不同提取物中26種化合物。分別將行為學(xué)指標(biāo)爬桿時間、紋狀體DA水平與所得到的特征峰進(jìn)行PLSR分析，評價各成分對藥效作用的貢獻(xiàn)，再將對爬桿時間和DA水平起較大貢獻(xiàn)的2組成分進(jìn)行合并分析，發(fā)現(xiàn)杜仲醇苷、鵝掌楸苷、5-羥甲基糠醛、咖啡酸等成分既能改善PD小鼠運動障礙，又能升高其紋狀體DA水平，可能是杜仲治療PD的藥效成分。 PD患者及動物模型體內(nèi)存在氧化應(yīng)激和神經(jīng)損傷，并伴隨著炎癥的產(chǎn)生[25-26]。據(jù)文獻(xiàn)報道[27]，鵝掌楸苷具有抗炎鎮(zhèn)痛作用；5-羥甲基糠醛具有抗氧化、腦神經(jīng)保護(hù)的作用，且能減輕紋狀體神經(jīng)元損傷[28-29]；咖啡酸具有抗氧化、抗炎及抑菌作用[30]，這與本實驗結(jié)果一致。下一步將繼續(xù)對這幾種成分進(jìn)行藥效驗證，為深入研究杜仲治療PD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。 參考文獻(xiàn)（略） 來 源：李莉莉，馬寧寧，范姍姍，馬 靜，楊昌碩，郭 虹，宋麗麗，莊朋偉. 杜仲不同提取物對帕金森病小鼠的治療作用及譜效關(guān)系研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(6):1400-1407.
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