四倍體金銀花水提物抗炎作用和急性毒性實(shí)驗(yàn)研究 |
發(fā)布時(shí)間:2022-06-12 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):693 |
四倍體金銀花水提物抗炎作用和急性毒性實(shí)驗(yàn)研究
摘要:目的 對(duì)四倍體金銀花水提物的抗炎作用以及急性毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 以二倍體金銀花為對(duì)照, 分別采用角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)、大鼠棉球肉芽腫實(shí)驗(yàn)對(duì)四倍體金銀花水提物進(jìn)行抗炎活性評(píng)價(jià);采用Bliss法測(cè)定小鼠的半數(shù)致死量(LD50)對(duì)其進(jìn)行急性毒性評(píng)價(jià)。結(jié)果 四倍體金銀花水提物具有明顯的抗急性炎癥作用, 與親本二倍體金銀花之間抗炎作用差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 2個(gè)種質(zhì)均不具有明顯的抗亞急性炎癥作用。四倍體和二倍體金銀花水提物ig給藥對(duì)小鼠的LD50值分別為72.12、69.92 g/kg, 急性毒性差異不明顯, 分別相當(dāng)于人體(體質(zhì)量60 kg)安全用量的412和400倍。結(jié)論 四倍體金銀花水提物具有明顯的抗急性炎癥作用, 在一定劑量范圍內(nèi)使用較為安全。 關(guān)鍵詞: 金銀花 四倍體 二倍體 抗炎作用 急性毒性Experimental study on anti-inflammatory effects and acute toxicity of aqueous extract from tetraploid Lonicerae Flos HU Xuan1,2mchuxuan@163.com, LI Wei-dong2,3Corresponding authorliweidong2005@126.com, ZHANG Shuo-feng2Corresponding authorshuofengzhang@sina.com, LI Ou2, HAO Jiang-bo2,3, MO Chou2,3 Abstract: Objective To evaluate the anti-inflammatory effects and acute toxicity of the aqueous extract form tetraploid Lonicerae Flos. Methods Compared with the diploid, the paw swelling of rats induced by carrageenan and cotton pellet granuloma tests were obtained to study the anti-inflammatory effects of the tetraploid Lonicerae Flos. A pretest was used to judge the possibility of LD50 in the acute toxicity test. The experimental data are calculated LD50 on mice by Bliss method to evaluate the acute toxicity of the diploid Lonicerae Flos. Results The tetraploid Lonicerae Flos had the significant resistance to acute inflammation, but there was not significance between the two ploidies. Neither the tetraploid nor the diploid had the obvious subacute inflammation resistance effects. The possibility of measuring LD50 was definite through pre-test. The LD50 of the aqueous extract from the two ploidies were 72.12 and 69.92 g/kg, respectively. However, there was no obvious difference in acute toxicity between the two ploidies. And the LD50 of mice was equal to 412 and 400 times of 60 kg normal humans daily dried medicinal herb expenses respectively. Conclusion The tetraploid Lonicerae Flos has the significant anti-inflammation with less toxic and side effect. It could be used safely in a certain dose range. Key words: Lonicerae Flos tetraploid diploid anti-inflammation acute toxicity 金銀花Lonicerae Flos為忍冬科(Caprifoliaceae)植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥花蕾或帶初開的花,性味甘、寒[1]。其具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱之功效,主治癰腫疔瘡、丹毒、喉痹、風(fēng)熱感冒、熱毒血痢、溫病發(fā)熱[2]。金銀花是重要的大宗藥材,也是重要的藥食兩用藥材,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日化用品等領(lǐng)域,特別是在抗擊非典型肺炎中發(fā)揮了重要作用。 為開辟金銀花新藥源,以二倍體金銀花“大毛花”為親本,采用秋水仙素誘導(dǎo)培育而成了四倍體金銀花“九豐一號(hào)”,并通過了國(guó)家級(jí)品種審定。四倍體金銀花具有產(chǎn)量高[3]、品質(zhì)優(yōu)、抗逆性強(qiáng)、采摘省工[4, 5]等優(yōu)勢(shì),已在全國(guó)大面積推廣種植。前期研究表明,四倍體金銀花中綠原酸和木犀草苷的量顯著高于二倍體金銀花[6],但是,目前缺乏其藥效學(xué)和相關(guān)安全性評(píng)價(jià)研究。已獲得的大部分多倍體藥材如丹參[7]、天山雪蓮[8]、白術(shù)[9]、板藍(lán)根[10]等是從產(chǎn)量和化學(xué)的角度對(duì)藥材進(jìn)行分析評(píng)價(jià),目前缺少多倍體藥材藥效和毒性研究。本研究選擇四倍體金銀花為受試藥物,以二倍體金銀花為對(duì)照藥材,對(duì)四倍體金銀花水提物的抗炎作用和急性毒性進(jìn)行評(píng)價(jià),探究四倍體金銀花臨床應(yīng)用的可能性和安全性。 1 材料 1.1 藥材 以山東平邑九間棚基地種植的四倍體金銀花“九豐一號(hào)”品種為受試藥材,以二倍體金銀花“大毛花”品種為對(duì)照藥材,同期分別采集2個(gè)品種的第1茬二白期鮮花蕾,鮮花蕾采用滾筒殺青烘干加工方法干燥[7],樣品由北京中醫(yī)藥大學(xué)李衛(wèi)東副研究員鑒定均為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的干燥花蕾。 1.2 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠,雄性,體質(zhì)量180~200 g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,合格證號(hào)SCXK(京)2007-0001。清潔級(jí)ICR小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量18~22 g,由斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供,合格證號(hào)SCXK(京)2011-0004。 1.3 藥品和試劑 醋酸地塞米松片,天津太平洋制藥有限公司提供,批號(hào)1110020;慶大霉素,上海現(xiàn)代哈森(商丘)藥業(yè)有限公司提供,批號(hào)10040512;角叉菜膠,Sigma公司提供,批號(hào)127H1227;棉球,每個(gè)50 mg,高壓滅菌,加入慶大霉素0.1 mL,50 ℃烘箱烤干。 2 方法 2.1 金銀花提取物的制備 取四倍體金銀花藥材500 g,用20倍蒸餾水浸泡靜置40 min后煎煮30 min,用4層紗布濾過,濾渣再煎煮30 min,紗布濾過后合并濾液,煎液減壓濃縮至含生藥0.595 g/mL,置于冰箱備用,臨用前稀釋。取二倍體金銀花對(duì)照藥材500 g,同樣方法制備水提物。 急性毒性實(shí)驗(yàn)受試和對(duì)照藥材制備方法同前,但受試藥材濃縮至混懸液含生藥1.85 g/mL,確定為小鼠ig給藥的最大質(zhì)量濃度。對(duì)照藥材濃縮至混懸液含生藥2 g/mL。 2.2 角叉菜膠致大鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)[11] 取SD大鼠78只,隨機(jī)分成6組,分別為模型組,陽性對(duì)照組,四倍體金銀花水提物高、低劑量(2.97、1.44 g/kg)組,二倍體金銀花水提物高、低劑量(2.97、1.44 g/kg)組,每組13只。模型組ig給予等量的蒸餾水,陽性對(duì)照組ig給予醋酸地塞米松溶液0.5 mg/kg,四倍體金銀花提取物組和二倍體金銀花水提物組分別ig給予相應(yīng)劑量的提取物,各組每天給藥1次,連續(xù)5 d。于末次給藥后1 h,在每只大鼠右后足跖部皮內(nèi)注射1%角叉菜膠0.1 mL,分別于致炎后1、2、4、6 h用軟皮尺測(cè)量右后足跖周長(zhǎng),并測(cè)量左后足跖相應(yīng)部位的周長(zhǎng),計(jì)算腫脹率。 腫脹率=(右后足跖周長(zhǎng)-左后足跖周長(zhǎng))/左后足跖周長(zhǎng) 2.3 大鼠棉球肉芽腫增生實(shí)驗(yàn)[12] 大鼠分組和給藥劑量、途徑同“2.2”項(xiàng)。各組大鼠用水合氯醛麻醉,在無菌條件下于腹部正中作一開口,用止血鉗剝離皮膚至腹股溝處,將預(yù)先高壓滅菌并加入慶大霉素0.1 mL的50 mg棉球植入腹股溝處。待動(dòng)物清醒后開始給藥,連續(xù)14 d。末次給藥后1 h,脫頸椎處死大鼠,剝離并取出棉球肉芽腫組織,置于電子天平上稱質(zhì)量,即為棉球肉芽腫濕質(zhì)量,將棉球肉芽腫置于110 ℃烘箱中,干燥48 h,取出稱量即為棉球肉芽腫干質(zhì)量。分別用棉球肉芽腫濕質(zhì)量或干質(zhì)量減去原棉球質(zhì)量即為肉芽腫質(zhì)量。 2.4 急性毒性實(shí)驗(yàn)[13] 取小鼠100只,雌雄各半,隨機(jī)分為10組,1~5組為不同劑量的四倍體金銀花水提物組,給藥劑量分別為90.80、75.67、62.06、52.55、43.79 g/kg,6~10組為不同劑量的二倍體金銀花水提物組,給藥劑量分別為83.33、69.44、57.87、48.22、40.19 g/kg,給藥體積均為小鼠最大給藥量。給藥前,小鼠禁食12 h(自由飲水),于次日上午ig給藥1次,常規(guī)飼養(yǎng),連續(xù)觀察14 d,記錄動(dòng)物的毒性反應(yīng)和死亡情況。在給藥14 d后處死所有小鼠,肉眼觀察小鼠主要臟器的變化,發(fā)現(xiàn)病變情況需要做組織病理學(xué)檢查。 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 抗炎實(shí)驗(yàn)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示,組間比較采用單因素方差分析;急性毒性實(shí)驗(yàn)中半數(shù)致死劑量(LD50)采用Bliss法進(jìn)行計(jì)算。 3 結(jié)果 3.1 對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響 由表 1可知,四倍體、二倍體金銀花水提物各劑量組在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)可明顯減輕大鼠的足腫脹程度。其中四倍體金銀花水提物高劑量組在致炎后2、4、6 h,低劑量組在致炎后1、4、6 h作用明顯,與模型組比較,大鼠足腫脹率明顯降低(P<0.05、0.01)。二倍體金銀花水提物高、低劑量組在致炎后各時(shí)間點(diǎn)作用明顯,與模型組比較,大鼠足腫脹率明顯降低(P<0.05、0.01)。四倍體金銀花水提物和二倍體金銀花水提物各組之間差異不顯著。 點(diǎn)擊查看表格內(nèi)容 表 1 四倍體和二倍體金銀花水提物對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹的影響 (±s, n = 13) Table 1 Effects of aqueous extract from tetraploid and diploid Lonicerae Flos on paw swelling of rats induced by carrageenan(±s,n = 13) 3.2 對(duì)大鼠棉球肉芽腫增生的影響 由表 2可知,四倍體和二倍體金銀花水提物各劑量組對(duì)大鼠棉球肉芽腫干、濕質(zhì)量無明顯影響。四倍體和二倍體金銀花水提物各劑量組間肉芽腫干、濕質(zhì)量差異不顯著。 點(diǎn)擊查看表格內(nèi)容 表 2 四倍體和二倍體金銀花水提物對(duì)大鼠棉球肉芽腫 質(zhì)量的影響(±s, n = 13) Table 2 Effects of aqueous extract from tetraploid and diploid Lonicerae Flos on granuloma quality of rats (±s,n = 13) 3.3 急性毒性反應(yīng)及LD50測(cè)定結(jié)果 四倍體和二倍體金銀花水提物各劑量組ig給藥后小鼠活動(dòng)量減少,食欲減弱,出現(xiàn)便溏現(xiàn)象,約15 h后恢復(fù)正常。動(dòng)物死亡主要發(fā)生在48 h內(nèi),對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行尸檢,裸眼下觀察心、肺、肝、腎、脾、胸腺等重要器官,無明顯異常。對(duì)存活下來的小鼠連續(xù)觀察14 d,情況良好,未出現(xiàn)其他毒性反應(yīng)情況,死亡情況也未繼續(xù)發(fā)生。給藥14 d后,處死所有小鼠,肉眼觀察其內(nèi)臟組織均未見明顯異常,統(tǒng)計(jì)各劑量組的死亡率,通過Bliss軟件計(jì)算四倍體和二倍體金銀花水提物的LD50分別為72.12、69.92 g/kg,95%可信限分別為64.83~82.93、62.13~84.99 g/kg,差異不顯著。結(jié)果見表 3。 點(diǎn)擊查看表格內(nèi)容 表 3 四倍體和二倍體金銀花水提物對(duì)小鼠急性毒性結(jié)果 Table 3 Results of aqueous extract from tetraploid and diploid Lonicerae Flos on LD50 of mice 4 討論 多倍體植物作為新藥用植物資源藥材在使用前,需要進(jìn)行有效性和安全性評(píng)價(jià)。藥用植物加倍后會(huì)導(dǎo)致化學(xué)組分和有效成分量的變化,研究報(bào)道,在相同劑量下,四倍體丹參比二倍體丹參有較強(qiáng)的改善微循環(huán)及增加微血管口徑的作用,而對(duì)毛細(xì)血管開放數(shù)的影響兩者無明顯差異[14]。但是目前關(guān)于多倍體的毒性研究未見報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)采用了急性和亞急性炎癥動(dòng)物模型,對(duì)四倍體金銀花水提物的抗炎作用進(jìn)行了探討。研究結(jié)果表明,四倍體金銀花與二倍體金銀花水提物在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能有效抑制大鼠角叉菜膠足跖腫脹,對(duì)急性滲出性炎癥均有明顯抑制作用,但是2個(gè)種質(zhì)之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,二者對(duì)慢性炎癥的肉芽組織增生均無明顯抑制作用。本研究表明,四倍體金銀花在急性滲出性炎癥方面能夠應(yīng)用于臨床。二倍體金銀花水提物高、低劑量組在致炎后1 h后有明顯抑制作用,而四倍體金銀花水提物只有低劑量組在致炎后1 h有明顯抑制作用,表明在相同劑量下,四倍體和二倍體產(chǎn)生抑制作用的時(shí)間點(diǎn)是有差異的,這種差異有待于進(jìn)一步研究。 急性毒性實(shí)驗(yàn)中四倍體和二倍體金銀花水提物均未使小鼠有明顯臨床中毒表現(xiàn),但是出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,通過預(yù)試驗(yàn)判斷存在LD50。采用Bliss法計(jì)算四倍體和二倍體金銀花水提物的LD50,兩者的95%可信區(qū)間范圍較窄,方法精確度高。四倍體金銀花水提物L(fēng)D50值為生藥72.12 g/kg,按《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定金銀花人體日用量為6~15 g[1],按60 kg體質(zhì)量算,相當(dāng)于人體安全用量的412倍,二倍體金銀花水提物L(fēng)D50值為69.92 g/kg,相當(dāng)于人體用量的400倍,兩者急性毒性相當(dāng),沒有顯著差異。一般按體質(zhì)量計(jì)算,小鼠最大給藥量相當(dāng)于成人臨床日用量100倍以上則認(rèn)為是較為安全的[15]。本研究認(rèn)為,四倍體金銀花在一定劑量?jī)?nèi)使用是安全的。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明四倍體金銀花抗炎作用與急性毒性同親本二倍體金銀花比較,并無顯著差異,為四倍體金銀花的開發(fā)利用提供了初步的藥效學(xué)和毒理學(xué)基礎(chǔ),其臨床應(yīng)用有效性及安全性尚需深入探討。 參考文獻(xiàn) [1] 中國(guó)藥典 [S]. 一部. 2010. 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