大黃中主要成分清除超氧陰離子自由基的ESR實(shí)驗(yàn)研究 | 大黃中主要成分清除超氧陰離子自由基的ESR實(shí)驗(yàn)研究 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 發(fā)布時(shí)間:2012-09-26 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):7026 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
大黃中主要成分清除超氧陰離子自由基的 摘 要 ABSTRACT目的：通過(guò)研究蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L．）中主要成分大黃酸（Rhein）、蘆薈大黃素(Aloe-emodin)、大黃素(Emodin)、大黃素甲醚(Physcion)和大黃酚(Chrysophanol)清除超氧陰離子自由基（O2˙）的作用，從分子生物學(xué)的角度探討大黃延緩衰老作用的可能機(jī)理。 方法：1．采用pH梯度萃取法提取分離大黃的主要成分大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚和大黃酚，并采用硅膠柱色譜法分離大黃素甲醚和大黃酚。 2．應(yīng)用熔點(diǎn)測(cè)定法、薄層色譜法、紫外光譜法及高效液相色譜法鑒定并測(cè)定其純度。 3．以二甲基亞砜（DMSO）在堿性有氧條件下產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2˙），利用公式E＝(h0－h(huán)x)/h0×100%（其中E為清除率，h0為加藥前O2˙的信號(hào)強(qiáng)度，hx為加藥后O2˙的信號(hào)強(qiáng)度），采用電子自旋共振法（ESR）檢測(cè)體系中O2˙信號(hào)強(qiáng)度，通過(guò)與未加藥樣的空白體系中O2˙信號(hào)強(qiáng)度的比較，以VitC為陽(yáng)性對(duì)照，研究大黃中主要成分大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚和大黃酚對(duì)超氧陰離子自由基（O2˙）的清除能力。 結(jié)果：大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚和大黃酚均有良好的清除超氧陰離子自由基（O2˙）的作用，隨著藥物濃度的增高，對(duì)O2˙的清除作用增強(qiáng)，呈劑量依賴性。大黃酸、大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和VitC對(duì)O2˙的清除率為100％時(shí)的濃度分別為0.06mg/ml、0.39mg/ml、0.46mg/ml、6.82mg/ml、1.18mg/ml、0.72mg/ml。 結(jié)論：大黃所具有的延緩衰老的作用，可能與其所含的主要成分大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚和大黃酚具有清除O2˙的能力有關(guān)。 主題詞：大黃/藥理學(xué) 蒽醌類/藥理學(xué) 抗氧化藥/藥理學(xué) 自由基清除劑/藥理學(xué) 衰老/藥物作用 電子自旋共振譜學(xué)/方法 ESR study on the scavenging effects of the main ingredients in Rheum palmatum L. on superoxide anion radical Major: Prescription of TCM Postgraduate: Luo Zhiyi Supervisor: Prof. Bao Guorong ABSTRACTObjective To study the scavenging effects of Rhein、Aloe-emodin、Emodin、Physcion and Chrysophanol which were the main ingredients in Rheum palmatum L．on superoxide anion radical and to investigate the mechanism of Rheum palmatum L．in retarding aging at molecular biology lever． Method 1．Rhein、Aloe-emodin、Emodin、Physcion and Chrysophanol in Rheum palmatum L．were isolated respectively by pH gradient extraction method.And column chromatography was used to isolate and purify Physcion and Chrysophanol. 2．The melting point method、thin layer chromatography 、ultraviolet spectrophotometry and high performance liquid chromatography methods were used to identify and evaluate the purity of the the main ingredients in Rheum palmatum L． 3．The superoxide anion radical（O2˙） was produced in the alkaline dimethyl surfoxide（DMSO） system and electron spin resonance（ESR）was used to measure the signal intensity of it.The formula was:E=(h0－h(huán)x)/h0×100%（In it E was the clearance rate, h0 was the signal intensity of O2˙before the drug was added,hx was the signal intensity of O2˙after the drug was added）.The method was used to observe the scavenging effect on the superoxide anion radical（O2˙）of Aloe-emodin、Rhein、Emodin、Physcion and Chrysophanol through comparing the signal intensity of O2˙which the drugs had been added with those not added ones,VitC was the positive control ones. Results All of the Rhein、Aloe-emodin、Emodin、Physcion and Chrysophanol were effective in scavenging the superoxide anion radical（O2˙）produced in the alkaline DMSO system，and the ability was dose- dependent．When the clearance rate reached 100%,the concentrations of Rhein、Chrysophanol、Emodin、Aloe-emodin、 Physcion、and VitC were 0.06mg/ml、0.39mg/ml、0.46mg/ml、6.82mg/ml、1.18mg/ml、0.72mg/ml． Conclusions：Rheum palmatum L．has the effect of retarding aging．Perhaps this is relevant to the scavenging effect on the superoxide anion radical（O2˙）of the main ingredients in the herb． Key words： rheum palmalum/pharmacol anthraquinones/pharmacol antioxidants/pharmacol free radical scavengers/pharmacol aging/drug effect electron spin resonance spectroscopy/methods 前 言 INTRODUCTION 進(jìn)入21世紀(jì)后，人類面臨人口老齡化的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，許多國(guó)家（包括我國(guó)）已經(jīng)進(jìn)入人口老齡化社會(huì)，≥60歲的老年人占總?cè)丝诘?0％以上。目前，我國(guó)老年人已達(dá)1億三千多萬(wàn)，衰老嚴(yán)重地困擾著老年人，直接影響他們的健康狀況和生活質(zhì)量。延緩衰老這一世界性的醫(yī)學(xué)課題在我國(guó)日益受到普遍關(guān)注。探明衰老的本質(zhì)及尋找有效的延緩衰老藥物已成為當(dāng)前老年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。 祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)不僅在長(zhǎng)期積累中形成了獨(dú)特的延緩衰老理論，而且在延年益壽的實(shí)際應(yīng)用中確實(shí)發(fā)現(xiàn)了許多具有延緩衰老作用的單味藥和復(fù)方制劑。在科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對(duì)衰老機(jī)理研究逐步深入的推動(dòng)下，研究的重點(diǎn)也從生物體整體或組織逐漸過(guò)渡到細(xì)胞、亞細(xì)胞、分子生物學(xué)水平，并運(yùn)用跨學(xué)科知識(shí)對(duì)延緩衰老理論及藥物的作用機(jī)理進(jìn)行全面探索和綜合評(píng)價(jià)。許多學(xué)者對(duì)傳統(tǒng)中藥在壽命實(shí)驗(yàn)，防御自由基損害，抗突變能力，改善循環(huán)，調(diào)節(jié)免疫、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌功能及新陳代謝等方面進(jìn)行了較為系統(tǒng)的現(xiàn)代藥理學(xué)研究，顯示這一領(lǐng)域蘊(yùn)藏著巨大的開發(fā)潛力。因此，從天然藥物中篩選和開發(fā)療效確切、安全無(wú)毒的新藥是當(dāng)前延緩衰老研究中的思路之一。 提取中藥有效成分或有效部位，開發(fā)單味藥及復(fù)方中藥制劑中單味藥的有效成分或有效部位是新藥研發(fā)中的趨勢(shì)。大黃是一種極有開發(fā)價(jià)值的藥用植物，其化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用均進(jìn)行了較深入的研究，它在清除氧自由基、降血脂、抗動(dòng)脈硬化、抗癌、延緩衰老等方面都有顯著的藥理作用[1]。大黃及其組成的復(fù)方具有延年益壽、延緩衰老的作用[2][3][4]，大黃單味藥提取液能清除自由基[5][6]。大黃作為傳統(tǒng)的抗衰老藥物[7][8]，顯示了良好的延緩衰老作用。 國(guó)內(nèi)外有關(guān)衰老機(jī)制的學(xué)說(shuō)很多，如自由基學(xué)說(shuō)、交聯(lián)學(xué)說(shuō)、內(nèi)分泌學(xué)說(shuō)、差錯(cuò)學(xué)說(shuō)、免疫學(xué)說(shuō)、脂褐素學(xué)說(shuō)、基因?qū)W說(shuō)、生物膜損傷學(xué)說(shuō)、微量元素學(xué)說(shuō)、自體中毒學(xué)說(shuō)、剩余信息假說(shuō)等[9]，這些學(xué)說(shuō)從不同角度、不同層面闡述了衰老的機(jī)理，其中自由基學(xué)說(shuō)與衰老關(guān)系的研究異常活躍，自由基學(xué)說(shuō)已被公認(rèn)為人類衰老機(jī)理現(xiàn)代理論中具有代表性的學(xué)說(shuō)之一。 自由基是指在原子的外層軌道上具有未配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)或分子的總稱。在生物體內(nèi)常見的自由基種類很多，而超氧陰離子自由基是其中很重要的一種，它會(huì)誘發(fā)其它自由基的生成。大多數(shù)自由基是不穩(wěn)定的，存在的時(shí)間很短，但由于其化學(xué)性質(zhì)極其活潑，所以作為反應(yīng)中間物在生物體內(nèi)起著重要作用。正常情況下機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除維持在一個(gè)正常的生理水平上，過(guò)多或過(guò)少都會(huì)給機(jī)體造成損傷。當(dāng)這一平衡被破壞，自由基產(chǎn)生過(guò)多或清除能力下降，在體內(nèi)積聚，就會(huì)引起生物大分子如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞和機(jī)體的衰老[10]。自由基的含量隨年齡的增長(zhǎng)而升高，由自由基促成的脂質(zhì)過(guò)氧化作用及生成的過(guò)氧化脂類隨年齡而增加。機(jī)體衰老時(shí)，抗氧化系統(tǒng)抗氧化能力下降，自由基代謝產(chǎn)物丙二醛（MDA）含量增加，引起組織損害和器官退行性變化，進(jìn)而加速機(jī)體衰老[11]。 因此，我們擬采用電子自旋共振法，以二甲基亞砜（DMSO）在堿性有氧條件下產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2˙），觀察大黃中主要成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚和大黃酚清除超氧陰離子自由基（O2˙）的能力，嘗試從清除自由基的角度探討大黃延緩衰老作用的可能機(jī)理。 一、實(shí)驗(yàn)用儀器與試藥 MATERIALS 1 生大黃藥材 為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L．）的干燥根莖，由甘肅藥材有限責(zé)任公司提供，經(jīng)福建中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥用植物教研室盧偉副教授鑒定，符合《中華人民共和國(guó)藥典》（2000年版）規(guī)定。 2 主要試劑 （1）石油醚（30～60℃）（AR） 上海聯(lián)試化工試劑有限公司 （2）石油醚（60～90℃）（AR） 上海聯(lián)試化工試劑有限公司 （3）醋酸乙酯（AR） 上海試劑四廠昆山分廠 （4）甲酸（AR） 廣東汕頭市西隴化工廠 （5）環(huán)己烷（AR） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上�；瘜W(xué)試劑公司 （6）正己烷（AR） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上�；瘜W(xué)試劑公司 （7）乙醚（AR） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上�；瘜W(xué)試劑公司 （8）三氯甲烷（AR） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上�；瘜W(xué)試劑公司 （9）甲醇（AR） 中國(guó)聯(lián)試化工試劑有限公司 （10）甲醇（色譜純） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上�；瘜W(xué)試劑公司 （11）磷酸（AR） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上�；瘜W(xué)試劑公司 （12）氨水（AR） 中國(guó)聯(lián)試化工試劑有限公司 （13）甲酸乙酯（AR） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司 （14）異戊醇（AR） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上�；瘜W(xué)試劑公司 （15）丙酮（AR） 中國(guó)聯(lián)試化工試劑有限公司 （16）吡啶（AR） 中國(guó)聯(lián)試化工試劑有限公司 （17）掌葉大黃對(duì)照藥材（批號(hào)：0902－9806） 中國(guó)藥品生物制品檢定所 （18）大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：0757－200005） 中國(guó)藥品生物制品檢定所 （19）大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：758－200006） 中國(guó)藥品生物制品檢定所 （20）大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756－200110） 中國(guó)藥品生物制品檢定所 （21）蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)：0795－9803） 中國(guó)藥品生物制品檢定所 （22）大黃酸對(duì)照品（批號(hào)：757－9302） 中國(guó)藥品生物制品檢定所 （23）抗壞血酸（AR） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上�；瘜W(xué)試劑公司 （24）薄層層析硅膠H（60型）（CP） 中國(guó)青島海洋化工集團(tuán)公司 （25）薄層層析硅膠G（60型）（CP） 中國(guó)青島海洋化工集團(tuán)公司 （26）層析用硅膠（100～200目） 上海五四化學(xué)試劑廠 （27）羧甲基纖維素鈉（CMC－Na） 上海化學(xué)試劑站分裝廠 3 主要儀器 （1）ER－420型電子自旋共振波譜儀 德國(guó)Bruker公司 （2）TSP高效液相色譜儀 美國(guó)TSP公司 （3）TSP－P2000二元梯度泵 美國(guó)TSP公司 （4）TSP－UV2000雙波長(zhǎng)紫外—可見檢測(cè)器 美國(guó)TSP公司 （5）BS－210S型電子分析天平 德國(guó)Satorius公司 （6）BP－211D型電子分析天平 德國(guó)Satorius公司 （7）UV－2100雙光束紫外－可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司 （8）SHB－Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司 （9）101A－1型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠 （10）WS70－1型紅外線快速干燥箱 上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠 （11）YB－Z型真空恒溫干燥箱 天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠 （12）BS－100A型自動(dòng)部份收集器 上海市滬西儀器廠 （13）HH－S2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海錦屏儀器儀表有限公司 （14）KQ－5000E型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司 （15）WC－1型顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀 四川大學(xué)儀器廠 （16）TN－100B型托盤扭力天平 上海第二天平儀器廠 （17）pHS－3C型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司 （18）RE－52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠 （19）雙底展開槽（200mm×200mm） 上海信誼玻璃儀器廠 二、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果 METHODS AND RESULTS 1 大黃的生藥學(xué)研究 1．1 來(lái)源：本品為購(gòu)自主產(chǎn)地甘肅禮縣的蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.的干燥根及根莖。秋末莖葉枯萎或次春發(fā)芽前采挖，除去細(xì)根，刮去外皮，切瓣或段，繩穿成串干燥或直接干燥，即得。 1．2 性狀鑒別：本品呈類圓柱形、圓錐形、卵圓形或不規(guī)則塊狀，長(zhǎng)3～17cm，直徑3～10cm。除盡外皮者表面黃棕色至紅棕色，可見類白色網(wǎng)狀紋理及星點(diǎn)(異型維管束)散在，殘留的外皮棕褐色，多具繩孔及粗皺紋。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，中心稍松軟，斷面淡紅棕色或黃棕色，顯顆粒性；根莖髓部寬廣，有星點(diǎn)環(huán)列或散在；根木部發(fā)達(dá)，具放射狀紋理，形成層環(huán)明顯，無(wú)星點(diǎn)。氣清香，味苦而微澀，嚼之粘牙，有砂粒感，唾液染成黃色。 1．3 顯微鑒別 1．3．1 取本品根莖橫切面：①木栓層及皮層大多已除去，偶有殘留。②韌皮部射線寬一至數(shù)列細(xì)胞，內(nèi)含棕色物。韌皮部中有粘液腔。③形成層環(huán)明顯。④木質(zhì)部導(dǎo)管稀疏，徑向排列，非木化。⑤髓部寬廣，有異常維管束，其形成層呈環(huán)狀，外側(cè)為木質(zhì)部，內(nèi)側(cè)為韌皮部，射線呈星狀射出，韌皮部中有粘液腔，內(nèi)含紅棕色物質(zhì)。薄壁細(xì)胞含淀粉粒及大形草酸鈣簇晶。 1．3．2 取本品粉末：呈淡黃棕色。①草酸鈣簇晶多，直徑21～125μm，棱角大多短鈍。②淀粉粒單粒呈圓球形或長(zhǎng)圓形，直徑5～32μm，臍點(diǎn)大多呈星狀；復(fù)粒由2～5分粒組成。③導(dǎo)管多為網(wǎng)紋，并有具緣紋孔及細(xì)小螺紋導(dǎo)管，直徑11～140μm，非木化。 2 大黃主要成分、結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 大黃主要含八類化學(xué)成分：蒽醌類化合物、雙蒽酮類化合物、苯丁酮苷類化合物、芪苷類化合物、萘苷類化合物、鞣質(zhì)及其有關(guān)化合物、其它有機(jī)化合物、無(wú)機(jī)物等[12]，蒽類衍生物是大黃中主要的活性成分[13]，其主要成分為蒽醌類化合物，總含量約2%～5%，其中游離的羥基蒽醌類化合物占1/10～1/5，主要為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚和大黃酚等，這是五種較為重要的成分[14]，也是形成蒽醌苷類的主要游離苷元。
大黃游離羥基蒽醌類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式 2．1 大黃素（Emodin）：分子式C15H10O5，分子量270.23。橙色長(zhǎng)針狀結(jié)晶（丙酮中結(jié)晶）或黃色長(zhǎng)針狀結(jié)晶（甲醇中結(jié)晶），mp.256～257℃。幾乎不溶于水，對(duì)下列溶劑的溶解度分別為：四氯化碳0.01％，氯仿0.0718％，二硫化碳0.009％，乙醚0.14％，苯0.041％。易溶于乙醇、氨水、碳酸鈉和氫氧化鈉水溶液[15]。 2．2 大黃酚（Chrysophanol）：分子式C15H10O4，分子量254.23。金黃色六角型片狀結(jié)晶（丙酮中結(jié)晶）或針狀結(jié)晶（乙醇中結(jié)晶），mp.196℃，能升華。易溶于乙醚、氯仿、苯、冰乙酸、乙醇，稍溶于甲醇，難溶于石油醚，不溶于水、碳酸氫鈉和碳酸鈉水溶液，可溶于氫氧化鈉水溶液及熱碳酸鈉水溶液[16]。 2．3 大黃素甲醚（Physcion）：分子式C16H12O5，分子量284.26。金黃色針狀結(jié)晶，mp.207℃，能升華�？扇苡跉溲趸c水溶液，溶解度與大黃酚相似[15]。 2．4 蘆薈大黃素（Aloe－emodin）：分子式C15H10O5，分子量270.23。橙色針狀結(jié)晶（甲苯中結(jié)晶），mp.223～224℃。易溶于熱乙醇，在乙醚及苯中呈黃色，在氨水及硫酸中呈緋紅色[16]。 2．5 大黃酸（Rhein）：分子式C15H8O6，分子量284.21。黃色針狀結(jié)晶（升華法），mp.321～322℃，330℃分解。幾乎不溶于水，溶于堿和吡啶，略溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚[16]。 3 大黃中化學(xué)成分的理化鑒別 3．1 取大黃粉末少量，加堿液呈紅色。 3．2 取本品粉末的稀乙醇浸出液，滴于濾紙上，再滴加稀乙醇，擴(kuò)散后呈黃色至淡棕色環(huán)，置紫外光燈（365nm）下觀察，呈棕色至棕紅色熒光。（檢查蒽醌衍生物） 3．3 取本品粉末少量，進(jìn)行微量升華，顯微鏡下觀察可見菱狀針晶或羽狀結(jié)晶。 3．4 取大黃粉末0.1g，加水50ml，置水浴上加熱30分鐘，濾過(guò)，濾液中加稀鹽酸2滴，用乙醚提取二次，每次20ml，除去乙醚層，水層加鹽酸5ml，置水浴中加熱30分鐘，冷卻，用乙醚20ml提取，分取乙醚層，加碳酸氫鈉試液10ml，振搖，水層顯紅色。（檢查羥基蒽醌衍生物） 3．5 取本品粉末0.1g，加甲醇20ml浸漬1小時(shí)，濾過(guò)，取濾液5ml，蒸干，加水10ml使溶解，再加鹽酸1ml，置水浴中加熱30分鐘，立即冷卻，用乙醚分2次提取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)勇确?ml使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對(duì)照藥材0.1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取大黃酸對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述三種溶液各4μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠H薄層板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的五個(gè)橙黃色熒光主斑點(diǎn)；在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，置氨蒸氣中熏后，日光下檢視，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色。（見附圖1、2） 4 大黃中游離羥基蒽醌類化合物的ESR試驗(yàn) 4．1 大黃中游離羥基蒽醌類化合物的提取分離和純化 4．1．1 提取工藝流程圖
4．1．2 總羥基蒽醌類成分的提取 稱取100g大黃粉末，先加入90ml 95％乙醇，使大黃粉浸潤(rùn)，再加入150～175ml 95％乙醇，在圓底燒瓶中加熱回流，趁熱抽濾（在該過(guò)程中，一定要避免極細(xì)小大黃顆粒進(jìn)入濾液），合并濾液，將濾液移入圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸餾濃縮，干燥，得含總羥基蒽醌類成分樣品。 4．1．3 游離羥基蒽醌類成分的分離 取上述乙醇提取樣品，加入150ml水，攪拌，用400ml乙醚，按150、100、100和50ml體積分4次萃取，合并乙醚層，抽濾，將濾液移入圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸餾濃縮，干燥，得總游離羥基蒽醌類成分樣品。 4．1．4 大黃酸的分離和純化 稱取適量總游離羥基蒽醌樣品，溶于200ml乙醚中，用400ml 5％NaHCO3溶液，按150、100、100和50ml體積分4次萃取，濾過(guò)，除去濾渣，合并水層，用鹽酸調(diào)至pH＝2，出現(xiàn)絮狀土黃色沉淀，濾過(guò)，先用水洗沉淀數(shù)次，再以少量冰冷的丙酮洗滌以除去有色雜質(zhì)。干燥后以冰醋酸結(jié)晶數(shù)次，得大黃酸黃色稻草束樣針狀結(jié)晶，mp.321～322℃。供ESR測(cè)試用。乙醚層留用。 4．1．5 大黃素的分離和純化 將大黃酸分離后的乙醚層用400ml 5％Na2CO3溶液，按150、100、100和50ml體積分4次萃取，濾過(guò)，除去濾渣，合并水層，用鹽酸調(diào)至pH＝1～2，出現(xiàn)黃褐色絮狀沉淀，濾過(guò)，先用水洗沉淀數(shù)次，再以少量冰冷的丙酮洗滌以除去有色雜質(zhì)。干燥后以冰醋酸結(jié)晶數(shù)次，得大黃素橙色大針狀結(jié)晶，mp.256～257℃。供ESR測(cè)試用。乙醚層留用。 4．1．6 蘆薈大黃素的分離和純化 將大黃素分離后的乙醚層用400ml 5％NaOH溶液，按150、100、100和50ml體積分4次萃取，濾過(guò)，除去濾渣，合并水層，用鹽酸調(diào)至pH＝2，出現(xiàn)黃色沉淀，濾過(guò)，用熱異戊醇將其溶解，濾過(guò)，將異戊醇濾液濃縮蒸干，得棕黑色粉末，加入CHCl3，加熱，使其溶解，溶液靜置2天，出現(xiàn)黃色析出物，濾過(guò)后先用水洗滌沉淀數(shù)次，再以少量冰冷的丙酮洗滌以除去有色雜質(zhì)。干燥后在醋酸乙酯中重結(jié)晶，得蘆薈大黃素橙色長(zhǎng)針狀結(jié)晶，mp.223～224℃。供ESR測(cè)試用。 加熱上述氯仿濾液，使濾液中的CHCl3揮發(fā)，得大黃酚與大黃素甲醚的混合物，用醋酸乙酯重結(jié)晶，得大黃酚和大黃素甲醚結(jié)晶，測(cè)得mp.196～207℃。另將熱異戊醇中的不溶物用熱吡啶溶解，濃縮蒸干，用醋酸乙酯重結(jié)晶，亦得大黃酚和大黃素甲醚的黃色結(jié)晶，mp.196～207℃。 4．1．7 大黃酚和大黃素甲醚的分離和純化 合并上述所得大黃酚和大黃素甲醚混合物，用硅膠柱色譜法分離。裝柱：取100～200目層析用硅膠250g，加石油醚(60～90℃)適量,調(diào)成混懸液，然后將其慢慢地、連續(xù)不斷地傾入層析柱內(nèi)（4.5×50cm），開啟下端活塞，使石油醚慢慢流出，帶動(dòng)吸附劑緩慢沉于柱的下端，待加完吸附劑后，繼續(xù)使石油醚流出，直至吸附劑的沉降不再變動(dòng)，將多余的石油醚放出至上面保持有5cm高度的液面為止。吸附劑高度約25cm。加樣：將大黃酚與大黃素甲醚1g，溶于適量氯仿，加吸附劑硅膠15g拌勻，除盡氯仿，再將其均勻鋪于柱頂。洗脫：開啟活塞，使高出樣品層的液面降至與樣品層上面齊平，再加石油醚至有1cm高液面，重復(fù)上述操作2～3次。然后將洗脫劑石油醚置于分液漏斗中，開啟活塞，慢慢連續(xù)不斷地滴加在柱床上部，同時(shí)開啟層析柱下端活塞進(jìn)行洗脫，流速控制在6～8m1/min。先洗脫者為大黃酚，后洗脫者為大黃素甲醚。純化：大黃酚用醋酸乙酯重結(jié)晶純化，得橙黃色葉狀結(jié)晶，mp.196℃。供ESR測(cè)試用。大黃素甲醚用醋酸乙酯重結(jié)晶純化，得橙黃色針狀結(jié)晶，mp.207℃。供ESR測(cè)試用。 4．2 大黃中提取的游離羥基蒽醌類化合物的純度鑒別與測(cè)定 4．2．1 薄層色譜法（TLC）鑒別 （1）薄層硅膠板的制備[17] 配制0.5％羧甲基纖維素鈉水溶液，靜置1周，取上清液與薄層層析硅膠H（60型），按3：1配制調(diào)漿，在研缽中向一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板(20cm×20cm)上平穩(wěn)地移動(dòng)涂布器進(jìn)行涂布，取下涂好薄層的玻板，于室溫下，置水平臺(tái)上晾干，在反射光及透射光下檢視，表面應(yīng)均勻，平整，無(wú)麻點(diǎn)、無(wú)氣泡、無(wú)破損及污染，于110℃下活化30min，冷卻后立即使用或置干燥器中備用。 （2）五種游離羥基蒽醌類成分的TLC鑒別 經(jīng)薄層色譜檢查，薄層板為硅膠H加0.3％羧甲基纖維素鈉水溶液自制板，展開劑為石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上層溶液，上行展開，展距約10cm，取出，晾干，經(jīng)氨蒸氣熏后，在可見光下可看到五個(gè)斑點(diǎn)，Rf值大到小分別為大黃酚、大黃素甲醚、大黃素、大黃酸和蘆薈大黃素。（見附圖3） （3）大黃酸的TLC鑒別 經(jīng)薄層色譜檢查（薄層色譜條件同上），在與大黃酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色黃色斑點(diǎn)；置紫外光燈（365nm）下檢視，在與大黃酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色橙色斑點(diǎn)，無(wú)其它雜質(zhì)斑點(diǎn)出現(xiàn)。（見附圖4、5） （4）大黃素的TLC鑒別 經(jīng)薄層色譜檢查（薄層色譜條件同上），在與大黃素對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色橙色斑點(diǎn)；置紫外光燈（365nm）下檢視，在與大黃素對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色橙色斑點(diǎn)，無(wú)其它雜質(zhì)斑點(diǎn)出現(xiàn)。（見附圖6、7） （5）蘆薈大黃素的TLC鑒別 經(jīng)薄層色譜檢查（薄層色譜條件同上），在與蘆薈大黃素對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色黃色斑點(diǎn)；置紫外光燈（365nm）下檢視，在蘆薈大黃素對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色橙色斑點(diǎn)，無(wú)其它雜質(zhì)斑點(diǎn)出現(xiàn)。（見附圖8、9） （6）大黃酚的TLC鑒別 經(jīng)薄層色譜檢查（薄層色譜條件同上），在與大黃酚對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色黃色斑點(diǎn)；置紫外光燈（365nm）下檢視，在與大黃酚對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，無(wú)其它雜質(zhì)斑點(diǎn)出現(xiàn)。(見附圖10、11) （7）大黃素甲醚的TLC鑒別 經(jīng)薄層色譜檢查（薄層色譜條件同上），在與大黃素甲醚對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色黃色斑點(diǎn)；置紫外光燈（365nm）下檢視，在與大黃素甲醚對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，無(wú)其它雜質(zhì)斑點(diǎn)出現(xiàn)。(見附圖12、13) 4．2．2 紫外光譜法（UV）鑒別 分別精密稱取所提取的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚各1mg，分別置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。以甲醇作空白，在紫外分光光度計(jì)上于200nm～400nm區(qū)間掃描測(cè)定紫外光譜。結(jié)果，最大吸收波長(zhǎng)分別為：蘆薈大黃素287nm、254nm、225nm、202nm，大黃酸258nm、231nm、204nm，大黃素289nm、266nm、253nm、222nm，大黃素甲醚286nm、265nm、253nm、223nm，大黃酚287nm、265nm、225nm、202nm。與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18][19]。紫外光譜圖見附圖14～18。 4．2．3 高效液相色譜法（HPLC）鑒別及純度測(cè)定 （1）色譜條件 DiamonsilTM（鉆石）C18（250mm×4.6mm,5μm）色譜柱,北京迪馬公司；JS－3030型色譜工作站，大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司；流動(dòng)相：甲醇－0.1%磷酸溶液(85∶15)；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；柱溫：室溫。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于1500。 （2）對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚對(duì)照品各5mg，分別置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取上述溶液各1ml，分別置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。 （3）供試品溶液的制備 分別精密稱取所提取的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚各5mg，分別置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密量取上述溶液各1ml，分別置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。 （4）測(cè)定 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀。結(jié)果表明，所提取的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚和大黃酚的保留時(shí)間與蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚和大黃酚對(duì)照品的保留時(shí)間一致；自制五種游離羥基蒽醌經(jīng)歸一化法進(jìn)行純度檢查，純度分別為97.5％、95.6％、97.8％、95.4％、96.7％。 經(jīng)熔點(diǎn)測(cè)定、TLC、UV和HPLC鑒別及純度測(cè)定表明，所提取的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚可供ESR測(cè)試用。 4．3 電子自旋共振法測(cè)試 4．3．1 操作參數(shù) 利用ER－420型電子自旋共振波譜儀，在液氮溫度下檢測(cè)O2˙量的變化情況。ESR操作參數(shù)件：X波段，調(diào)制頻率100KHz，調(diào)制幅度5G，掃描寬度500G，微波功率20mW，時(shí)間常數(shù)20ms，中心磁場(chǎng)3300G。 4．3．2 DMSO堿性溶液的配制 將一定量的固體NaOH溶于蒸餾水中，并標(biāo)定NaOH溶液濃度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，配成含NaOH 10mmol/L的DMSO溶液，溶液中的含水量均為1%（ml/ml）。 4．3．3 DMSO堿性體系中O2˙的產(chǎn)生 室溫下，將含有飽和空氣的DMSO與NaOH溶液、H2O充分混合，此時(shí)溶液中NaOH和H2O含量分別為5mmol/L和1％（ml/ml），在低溫（77K）下進(jìn)行ESR測(cè)定。ESR譜圖見附圖19所示。 將NaOH溶液和DMSO在混合前分別用真空（0.13Pa）脫氣法除氧，然后在與上面相同的濃度和室溫條件下將兩者混合，結(jié)果在相同ESR條件下未檢測(cè)到ESR信號(hào)；再將氧氣通入脫氣的混合液中，又獲得如附圖19所示的ESR譜圖。 上述試驗(yàn)過(guò)程表明O2直接參與了產(chǎn)生自由基的反應(yīng)。O2在DMSO堿性溶液中發(fā)生了單電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，產(chǎn)生O2˙ 。此反應(yīng)過(guò)程可用下式表示[20] 2˙OH+3O2+2(CH3)2SO →2CH3SOOH+CH3OOCH3+2 O2˙ 4．3．4 清除率的計(jì)算 超氧陰離子自由基的清除率以波譜信號(hào)第二峰高值（mm）表示信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度，用以下公式計(jì)算藥物對(duì)自由基的清除率E： E＝(h0－h(huán)x)/h0×100% 其中，h0為加藥前O2˙的信號(hào)強(qiáng)度（本底峰高）；hx為加藥后O2˙的信號(hào)強(qiáng)度（加藥后峰高）。 4．3．5 大黃中五種游離羥基蒽醌成分對(duì)超氧陰離子自由基清除作用的ESR檢測(cè) 分別將含有飽和空氣的DMSO溶液與NaOH溶液、H2O于室溫下混合反應(yīng)，一經(jīng)加入NaOH立即計(jì)時(shí)，然后，定量吸取反應(yīng)液置于直徑為3mm的玻璃樣品管內(nèi)，在溫度77K時(shí)進(jìn)行ESR測(cè)定，此時(shí)可檢測(cè)到O2˙的特征信號(hào)，以此作為空白對(duì)照。另取數(shù)支樣品管，將含有飽和空氣的DMSO溶液分別與不同濃度水平的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚提取液、VitC混勻，然后再加入NaOH溶液，一經(jīng)加入立即計(jì)時(shí)，充分反應(yīng)后，用ESR方法檢測(cè)體系中O2˙信號(hào)強(qiáng)度的變化，通過(guò)與未加藥樣的空白對(duì)照體系中O2˙信號(hào)強(qiáng)度的比較，以VitC作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚對(duì)O2˙的清除作用，分別計(jì)算它們的清除率。 4．3．6 大黃中五種游離羥基蒽醌成分對(duì)超氧陰離子自由基清除作用的ESR檢測(cè)結(jié)果見下表
 
 濃度（mg/ml）
①大黃酸 ②大黃酚 ③大黃素 ④VitC ⑤大黃素甲醚 ⑥蘆薈大黃素
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚、VitC對(duì)O2˙的清除率與濃度呈劑量依賴性。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚和VitC對(duì)O2˙的清除率為100％時(shí)的濃度分別為6.82mg/ml、0.06mg/ml 、0.46mg/ml、0.39mg/ml、1.18mg/ml、0.72mg/ml。附圖20（a）顯示DMSO捕捉O2˙后在ESR上呈現(xiàn)的典型波譜，附圖20（b）、20（c）、20（d）、20（e）、20（f）、20（g）分別是加入大黃酚、VitC、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酸和大黃素后，當(dāng)達(dá)到100％清除O2˙后的ESR波譜。由圖可見：加入大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚后，ESR波譜的峰值明顯下降。說(shuō)明：大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚均有良好的清除超氧陰離子自由基的能力。 三、討 論 DISCUSSION 1 祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)大黃延緩衰老機(jī)理的認(rèn)識(shí) 大黃為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L．、唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim．ex Balf．或藥用大黃Rheum officinale Bail．的干燥根及根莖。大黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主產(chǎn)于四川、甘肅、青海、西藏、湖北、云南、貴州等地，多在秋末莖葉枯萎或次春發(fā)芽前采挖，除去細(xì)根，刮去外皮，切瓣或段，繩穿成串干燥或直接干燥。產(chǎn)品因加工不同分為生大黃、酒大黃、熟大黃、大黃炭。生大黃苦、寒；歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)；具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)之功，用于實(shí)熱便秘、積滯腹痛、瀉痢不爽、濕熱黃疸、血熱吐衄、目赤、咽腫、腸癰腹痛、癰腫疔瘡、瘀血經(jīng)閉、跌撲損傷，外治水火燙傷；上消化道出血。酒大黃善清上焦血分熱毒，用于目赤咽腫、齒齦腫痛。熟大黃瀉下力緩，瀉火解毒，用于火毒瘡瘍。大黃炭涼血化瘀止血，用于血熱有瘀出血癥。 中醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)衰老理論，多以“脾腎虛衰致衰老”為基本觀點(diǎn)，歷代延年益壽方藥的運(yùn)用也多以此為據(jù)。延緩衰老研究多以補(bǔ)虛延壽者為主，在眾多的延緩衰老藥品中，以滋補(bǔ)藥品占大多數(shù)。我們認(rèn)為衰老不單由臟腑氣血虛弱所致，菀陳瘀滯積蓄亦是重要原因。 菀陳瘀滯的積蓄是衰老的重要原因。菀者積也，陳者久也；瘀者血與津液不流暢也，滯者氣不行也；菀陳瘀滯，指體內(nèi)日漸積蓄的有害物質(zhì)。衰老的發(fā)生是一個(gè)逐漸演變的過(guò)程，《素問(wèn)·五臟別論》云：“所謂五臟者，藏精氣而不瀉也，故滿而不能實(shí)。六腑者，傳化物而不藏，故實(shí)而不能滿也。所以然者，水谷入口，則胃實(shí)而腸虛，食下則腸實(shí)而胃虛。故曰：實(shí)而不滿，滿而不實(shí)也[21]”。六腑以通為用，主傳化物、消化吸收水谷精微、滋養(yǎng)五臟，而五臟精氣，疏達(dá)氣血，以協(xié)調(diào)六腑，臟腑為合，相輔相成。年輕時(shí)臟腑功能正常，氣血旺盛，新陳代謝活躍，少有瘀滯形成者；進(jìn)入中老年以后，臟腑功能逐漸衰弱，新陳代謝日漸遲緩，氣行遲則滯，血流緩則瘀，津液輸布不利漬而成痰濕，飲食不化、或肥甘厚味過(guò)剩，則聚為菀陳。此既為臟腑虛衰的病理產(chǎn)物，又是導(dǎo)致臟腑功能進(jìn)一步減退的致病因素，因此《靈樞·營(yíng)衛(wèi)生會(huì)篇》云：“老者之氣血衰，其肌肉枯，氣道澀，五臟之氣相搏，其營(yíng)氣衰少，而衛(wèi)氣內(nèi)伐[22]”。 張從正曰:“脾主運(yùn)化，胃主消腐，總以通暢為貴，一有積滯，諸癥峰起”�！鹅`樞·天年篇》曰：“其不能終壽而死者，五藏皆不堅(jiān)，使道不長(zhǎng)……，薄脈少血，其肉不實(shí)，數(shù)中風(fēng)寒，血?dú)馓�，脈不通，真邪相攻，亂而相引，故中壽而盡也[23]”。這里明確指出，老者由于五臟不堅(jiān)，氣血虛弱，導(dǎo)致肌肉枯、氣道澀、脈不通、使道不長(zhǎng)，進(jìn)而營(yíng)氣衰少，衛(wèi)氣內(nèi)伐，稍感外邪即病，不盡天年而終。其中“氣道澀，脈不通”指的氣滯血瘀；“使道不長(zhǎng)”指五臟所發(fā)揮作用的道路不通暢，使氣血津液循行、運(yùn)化、疏泄的過(guò)程失常，致瘀滯形成，阻礙生理活動(dòng)的正常進(jìn)行，從而使臟腑器官、四肢百骸失養(yǎng)，而導(dǎo)致衰老，即菀陳瘀滯的積蓄是形成衰老的重要原因。既然菀陳瘀滯的形成是衰老的重要原因，且許多老年病均與其積蓄有關(guān)，故而去菀陳瘀滯就成為防治老年病、延緩衰老的重要方法。正如《中藏經(jīng)》所云：“其本實(shí)者，得宣通之性必延其壽 [24]�！鹅`樞·九針十二原》云：“虛則實(shí)之，滿則泄之，菀陳則除之[25]”。《靈樞·小針解》又進(jìn)一步解釋曰：“菀陳則除之者，去血脈也[26]”。這里講的雖是針刺的方法，卻提示了通利以去菀陳的治則�！皻庋獩_和，百病不生”，只有除菀陳積滯，使臟腑經(jīng)絡(luò)氣血通暢無(wú)阻，才能達(dá)到延年衰老之目的。 祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、止血、解毒、活血祛瘀等作用�！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》謂其“下瘀血、血閉寒熱，破癥瘕積聚、留飲宿食，蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調(diào)中化食，安和五臟[27]”�！读_氏會(huì)約醫(yī)鏡》云：“大黃能除腸胃燥結(jié)、宿食、瘀血。主……癥瘕積聚，消癰腫，化痞滿，通二便，損傷積血，……[28]”�！豆沤襻t(yī)鑒》云：“大黃奪土將軍，逐滯通瘀，下胃腸結(jié)熱 [29]”�！稖罕静荨吩疲骸按簏S，……，泄?jié)M，推陳致新，去陳垢而安五臟[30]”�！侗静萸笳妗吩疲骸啊磺邪Y瘕血燥，血秘實(shí)熱等證，用此皆能推陳致新，定亂致治 [31]”。大黃苦寒，苦能瀉，寒能清，推陳致新，使腑氣通，納化健，中氣調(diào)暢，又能破熱結(jié)，行瘀滯，使氣血流通，俾腑氣得通，氣血得運(yùn)，去菀除陳，則五臟安和矣。諸家論述為大黃延緩衰老的重要地位奠定了理論基礎(chǔ)。 2 大黃延緩衰老作用的現(xiàn)代研究進(jìn)展 現(xiàn)代研究證實(shí)，從波葉大黃中提取的波葉大黃多糖（RHP）0.2％或0.1％濃度均能顯著延長(zhǎng)兩性果蠅成蟲的平均壽命和最高壽命，與對(duì)照組相比，0.2％RHP組果蠅平均壽命分別延長(zhǎng)41.9％（雌）和48.8％（雄），最高壽命分別延長(zhǎng)60.6％（雌）和64.7％（雄）；0.1％RHP組果蠅平均壽命分別延長(zhǎng)24.7％（雌）和12.8％（雄），最高壽命分別延長(zhǎng)37.9％（雌）和55.9％（雄）[32]；常飲大黃水的駱駝壽命比一般駱駝可多活5年以上，常飲大黃水的牧駝人有長(zhǎng)壽傾向[33]；大黃水提物對(duì)小鼠肝勻漿過(guò)氧化脂質(zhì)生成具有明顯的抑制作用[34][35]；大黃能清除O2˙、H2O2和其他活性氧是一種有效的抗氧化劑[36]，其抗超氧負(fù)離子活性順序?yàn)槿A北大黃>河套大黃>唐古特大黃、掌葉大黃、藥用大黃、藏邊大黃[37]；大黃水煎液可顯著增強(qiáng)小鼠血中超氧化物歧化酶（SOD）[38][39]、谷胱甘肽過(guò)氧化物（GSH－Px）活性（P<0.05～0.01），而且這種作用在一定范圍內(nèi)有隨大黃用量增加而加強(qiáng)趨勢(shì)，這說(shuō)明大黃具有延緩衰老的作用[40]，并能明顯降低小鼠腦中B型單胺氧化酶（MAO－B）的活性[41]；口服不同劑量大黃水煎液，均具有促進(jìn)小鼠的牛血清白蛋白誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)及細(xì)菌脂多糖（LPS）和刀豆蛋白A（ConA）對(duì)脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)，說(shuō)明大黃具有促進(jìn)小鼠細(xì)胞免疫和淋巴細(xì)胞增殖的作用[42]；ig 波葉大黃多糖（RHP）100和200mg/kg能明顯增加小鼠脾臟和胸腺重量，與對(duì)照組相比，脾指數(shù)分別增加30％和38％，200mg/kg的劑量可使吞噬指數(shù)增加155％；能促進(jìn)小鼠碳粒廓清速率，K值分別比對(duì)照組增加48％和217％；能促進(jìn)SRBC致敏小鼠血清溶血素形成，HC50（半數(shù)溶血值）分別比對(duì)照組增加11％和57％；能促進(jìn)小鼠抗體形成細(xì)胞的生成，QHS（脾細(xì)胞介導(dǎo)紅細(xì)胞溶血分光光度計(jì)測(cè)定法）分別比對(duì)照組增加63％和126％。RHP還可明顯促進(jìn)受Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞DNA的合成，最適濃度為20μg/ml，刺激指數(shù)為1.61；對(duì)Con A活化的脾淋巴細(xì)胞蛋白質(zhì)合成也有明顯促進(jìn)作用，刺激指數(shù)為1.15；對(duì)Con A誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞IL－2產(chǎn)生有明顯增強(qiáng)作用[43]。 20世紀(jì)初期，梅契尼科夫[44]提出自體中毒學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為人體腸道中所寄居的細(xì)菌，尤其是大腸桿菌，在代謝中會(huì)產(chǎn)生大量的毒物，如吲哚、吲哚乙酸等。這些毒物被吸收后會(huì)導(dǎo)致機(jī)體慢性中毒,從而促成衰老。而便秘則無(wú)疑會(huì)加重這些有毒物質(zhì)的吸收。他建議用酸牛奶等發(fā)酵制品,以便引入大量的乳酸桿菌,抑制大腸菌群產(chǎn)生毒素,從而減緩自體中毒。之后，里卡爾又補(bǔ)充了代謝過(guò)程中也可產(chǎn)生毒素，如細(xì)胞代謝可產(chǎn)生胺、酮體、二氧化碳等，這些有毒的代謝產(chǎn)物如果積聚，也可使機(jī)體中毒，導(dǎo)致衰老或死亡，進(jìn)一步完善了此學(xué)說(shuō)。大黃具有瀉下作用[45]，能減少腸道內(nèi)有毒代謝產(chǎn)物，此亦是延緩衰老的重要途徑。其保肝[46]、降脂[47][48]、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖[49]等作用也有利于對(duì)衰老的防治。此外，大黃中含有多種微量元素如錳、鋅、鐵、鈣、鎂、銅、硒、鎳、鈉、鍶、鉻、銣、鍺等[50]，鈣、鎂、錳、硒、鋅、鍶、鉻、銣?zhǔn)蔷哂醒泳徦ダ献饔玫奈⒘吭?SUP>[51]，這些微量元素對(duì)于人體進(jìn)行生理活動(dòng)，是極其重要的[52]。 3 衰老與自由基 衰老是生命過(guò)程中正常的生理現(xiàn)象和病理反應(yīng)，是機(jī)體內(nèi)各種生化反應(yīng)的綜合過(guò)程，其機(jī)理較為復(fù)雜，一直為老年學(xué)、老年醫(yī)學(xué)、老年社會(huì)學(xué)以及生物學(xué)研究的前沿。近年來(lái)，各國(guó)學(xué)者在延緩衰老的研究中取得了許多突破性的進(jìn)展，并相繼提出了200余種衰老學(xué)說(shuō)，其中自由基學(xué)說(shuō)是人類衰老機(jī)理現(xiàn)代理論中有代表性的學(xué)說(shuō)之一。 自由基學(xué)說(shuō)是英國(guó)學(xué)者Denham Harman于1956年首先提出來(lái)的。其中心內(nèi)容是“自由基反應(yīng)普遍存在于生命有機(jī)體中，而且自由基是具有高度化學(xué)活性的中間體，衰老來(lái)自于正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基的隨機(jī)而破壞性的作用[53]”。 自由基（free radical）或稱游離基，是指在原子的外層軌道上具有未配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)、特殊狀態(tài)的分子或離子。通常在原子符號(hào)的后面或前面加一個(gè)小圓點(diǎn)，以表示非配對(duì)電子。它是一類具有高度活性的物質(zhì)，在正常的生命過(guò)程中為維持生命所必需的，但自由基也是生物大分子、細(xì)胞和生物組織的危險(xiǎn)的殺手[54]，可直接或間接的發(fā)揮其強(qiáng)氧化劑作用，從而損傷生物體的大分子和多種細(xì)胞成分。超氧陰離子自由基（O2˙）、羥自由基（˙OH）、氫過(guò)氧基（HO2˙）、烷氧基（RO˙）、烷過(guò)氧自由基（ROO˙）、酰氧自由基（RCOO˙）、脂質(zhì)氫過(guò)氧化物（ROOH）等含氧的活性物質(zhì)都具有較氧活潑的化學(xué)活性，統(tǒng)稱為活性氧，其中O2˙、˙OH、HO2˙、RO˙、ROO˙屬氧自由基。大多數(shù)自由基是不穩(wěn)定的，存在的時(shí)間很短，但由于其化學(xué)性質(zhì)極其活潑，所以作為反應(yīng)中間物在生物體內(nèi)起著重要作用。 在機(jī)體正常的代謝過(guò)程中，如細(xì)胞呼吸作用和線粒體內(nèi)的氧化過(guò)程均能產(chǎn)生超氧陰離子自由基、H2O2、羥基自由基(˙OH)、單線態(tài)氧(1O2)等許多自由基。機(jī)體內(nèi)除自由基途徑有兩條：一條是通過(guò)天然抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－Px）等一系列以不同基質(zhì)特異性組成的一個(gè)多水平的還原自由基及氫過(guò)氧化物系統(tǒng)；另一條是通過(guò)天然抗氧化劑途徑，如維生素E、維生素C，輔酶Q等，使自由基變成不活潑的分子，而自身比較穩(wěn)定。SOD、CAT、GSH－Px是機(jī)體清除自由基的主要抗氧化酶，它們的活性隨著年齡的增長(zhǎng)而下降，測(cè)定它們的活性可以比較全面的反映機(jī)體抗氧化能力。在生理情況下，機(jī)體自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)的平衡之中，不會(huì)造成危害。由于某些生理作用或生化反應(yīng)中需要O2˙和˙OH等參與，機(jī)體還要通過(guò)自由基的產(chǎn)生與消除來(lái)維持有利無(wú)害的、生理性低水平的、穩(wěn)定平衡的自由基濃度[55]。但在病理情況下，自由基的產(chǎn)生與清除失去了平衡，不論其原因是自由基的產(chǎn)生增加，還是機(jī)體清除自由基的能力減弱，或者兩者兼而有之，其后果是大量自由基不能完全被防御系統(tǒng)所清除，就會(huì)在體內(nèi)積累，引起生物大分子如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞和機(jī)體的衰老[56]。O2˙不僅本身是性質(zhì)活潑的自由基，而且是導(dǎo)致自由基連鎖反應(yīng)的啟動(dòng)者，促使其它類型自由基的生成。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)和臨床觀察表明，O2˙是許多生理和病理過(guò)程的參與者，許多疾病的發(fā)生及轉(zhuǎn)歸直接或間接與自由基有關(guān)。目前，在生物、物理、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域內(nèi)，有關(guān)O2˙的研究相當(dāng)活躍。 4 大黃酚和大黃素甲醚提取方法探討 大黃酚和大黃素甲醚結(jié)構(gòu)相似，酸性與極性相近，分離工作較為困難。文獻(xiàn)報(bào)道用纖維素粉柱層析[57]、硅膠柱層析[58][59]分離，但纖維素粉柱層析操作較麻煩且樣品上柱量少；硅膠柱層析樣品上柱量較大，但因使用兩種洗脫劑，溶劑消耗量大。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)反復(fù)摸索后發(fā)現(xiàn)將所分離的大黃酚和大黃素甲醚混合物用單一洗脫劑進(jìn)行柱層析分離，亦能較好的分離大黃酚和大黃素甲醚混合物。 本提取方法的優(yōu)點(diǎn)：（1）本方法較文獻(xiàn)報(bào)道的方法樣品上柱量大，溶劑單一，可反復(fù)套用，節(jié)省溶劑，樣品分離效果好；（2）分液漏斗為改進(jìn)后的分液漏斗，可以最大限度的減少洗脫劑的揮發(fā)，且干凈；（3）該方法適合基層制備標(biāo)準(zhǔn)品選用，因洗脫液的合并與否不需檢測(cè)，只需查看成分在吸附柱上的不同顏色即可。 5 國(guó)內(nèi)對(duì)中藥降自由基和ESR的研究狀況 近年來(lái)，我國(guó)和幾個(gè)發(fā)達(dá)國(guó)家的人口相繼出現(xiàn)了老齡化問(wèn)題，人口的老齡化日益成為一個(gè)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。鑒于衰老問(wèn)題是一個(gè)復(fù)雜而微妙的生命過(guò)程，在長(zhǎng)期研究過(guò)程中，從不同側(cè)面探索生命衰老過(guò)程中形成了衰老的有害物質(zhì)累積學(xué)說(shuō)、內(nèi)分泌功能減低學(xué)說(shuō)、器官功能減退學(xué)說(shuō)、衰老的免疫學(xué)說(shuō)、大分子交聯(lián)學(xué)說(shuō)、微量元素學(xué)說(shuō)、衰老的基因?qū)W說(shuō)、衰老的分子生物學(xué)、衰老的膜假說(shuō)、衰老的細(xì)胞分化障礙假說(shuō)以及衰老的自由基學(xué)說(shuō)。根據(jù)自由基理論，從深入地探討這些學(xué)說(shuō)理論的機(jī)制來(lái)考慮，自由基在上述學(xué)說(shuō)中都起著不可缺少的啟動(dòng)、介導(dǎo)作用，甚至自由基反應(yīng)就是上述學(xué)說(shuō)的組成部分[60]。 據(jù)報(bào)道[61]許多延緩衰老中藥可通過(guò)清除自由基，從而達(dá)到延緩衰老的目的。自由基清除劑正廣泛的應(yīng)用于衰老及老年病的防治。探索自由基的代謝規(guī)律和篩選合宜的天然藥物進(jìn)行調(diào)治，已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。目前延緩衰老中藥研究方法主要有：一、自由基測(cè)定方法；二、氧化性代謝產(chǎn)物測(cè)定方法（包括脂質(zhì)過(guò)氧化物測(cè)定、氫過(guò)氧化脂質(zhì)測(cè)定、脂褐質(zhì)測(cè)定）；三、抗氧化酶活性測(cè)定方法（包括超氧化物歧化酶測(cè)定、超氧化物歧化酶同工酶測(cè)定、過(guò)氧化氫酶測(cè)定、過(guò)氧化物酶測(cè)定、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶測(cè)定）；四、老化相關(guān)酶測(cè)定方法（包括單胺氧化酶測(cè)定、Na+，K+－ATP酶測(cè)定）；五、核酸蛋白測(cè)定方法（包括DNA、RNA含量測(cè)定、蛋白質(zhì)含量測(cè)定、膠原蛋白含量測(cè)定）[62]。自由基的測(cè)定方法有電子自旋共振波譜法、高效液相電化學(xué)檢測(cè)法、化學(xué)發(fā)光法和分光光度法等，其中電子自旋共振波譜法是普遍推崇的測(cè)量自由基的方法。電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）也稱電子自旋共振（electron spin resonance，ESR），這兩個(gè)名稱在當(dāng)今國(guó)際文獻(xiàn)中并行通用。ESR法操作簡(jiǎn)便，測(cè)量快速，精確度及靈敏度較高，不論是直接檢測(cè)或通過(guò)自旋捕集間接檢測(cè)都是特異性的。它是利用待測(cè)樣品中存在未配對(duì)的電子，具有帶電、自旋及磁偶極距的特點(diǎn)，在外磁場(chǎng)中，電子的自旋磁矩對(duì)外加磁場(chǎng)呈現(xiàn)兩種取向：一種是電子磁矩方向與外磁場(chǎng)方向相同，它的能量值較原平均值減少；另一種是電子磁矩方向與外磁場(chǎng)方向相反，能量較高。其相應(yīng)能量分別為－1/2gΒH和1/2gΒH，其中g(shù)一般稱為g因子，也稱光譜分裂因子，表征電子的自旋角動(dòng)量與其軌道角動(dòng)量對(duì)分子磁矩的相對(duì)貢獻(xiàn)；β是電子的波爾磁子；H為外加磁場(chǎng)。在垂直H的方向，再加一高頻磁場(chǎng)，使其頻率為V，此時(shí)，低能級(jí)的未配對(duì)電子則從高頻磁場(chǎng)吸收能量躍遷至高能級(jí)，這就產(chǎn)生電子能與輻射場(chǎng)共振。將這種能量吸收轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，進(jìn)行檢測(cè)、放大，則得到ESR波譜信號(hào)。ESR譜儀所能檢出的自由基的絕對(duì)濃度約在10－8M數(shù)量級(jí)左右。一般不需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的處理，可拿來(lái)直接測(cè)定。檢測(cè)后樣品不受破壞，對(duì)樣品自身反應(yīng)無(wú)干擾。對(duì)同一樣品可以反復(fù)測(cè)量�？梢宰粉櫡磻�(yīng)過(guò)程中順磁粒子的形成、消失、再生和轉(zhuǎn)移，闡明反應(yīng)的機(jī)制和動(dòng)態(tài)過(guò)程[63]。 有關(guān) O2˙的產(chǎn)生及其檢測(cè)方法的研究基本上都是通過(guò)對(duì)超氧化物歧化酶活性的測(cè)定，間接的推論O2˙的存在，而采用電子自旋共振（ESR）法[64]直接觀察O2˙產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)過(guò)程的工作則較少。用ESR法直接觀察O2˙信號(hào)的變化，并以此評(píng)估中藥對(duì)O2˙的增抑作用雖已有報(bào)道，但從大黃中提取單體的化學(xué)成分進(jìn)行ESR研究，以觀察其清除O2˙能力的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。 在實(shí)驗(yàn)條件下，ESR的測(cè)量必須在低溫下進(jìn)行，DMSO體系中會(huì)產(chǎn)生穩(wěn)定的超氧陰離子自由基O2˙，其ESR信號(hào)如附圖20所示。由附圖20測(cè)得ESR信號(hào)的各向異性因子g為：g//＝2.1015，g_＝2.0078，該信號(hào)是O2˙存在的表征，上述參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道的O2˙的特征參數(shù)一致[20][65]。因此，可用g_的信號(hào)幅度作為O2˙產(chǎn)物的相對(duì)濃度。O2˙的ESR信號(hào)強(qiáng)度與測(cè)定幅度有關(guān)，溫度越低，信號(hào)越強(qiáng)。我們根據(jù)實(shí)驗(yàn)的操作條件，選擇77K為測(cè)定溫度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在此溫度下產(chǎn)生O2˙的反應(yīng)不再進(jìn)行，這為在同一溫度條件下充分研究DMSO體系產(chǎn)生O2˙的變化提供了有利條件。另外，在DMSO堿性反應(yīng)體系中，O2˙的生成量與NaOH的濃度CNaOH有關(guān)，為得到一個(gè)既穩(wěn)定、又有利于檢測(cè)的反應(yīng)體系，經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索我們發(fā)現(xiàn)CNaOH濃度以10mmol/L較為適宜。 眾所周知，中藥材由于產(chǎn)地、采收季節(jié)、加工及炮制方法的不同，而使同種藥材所含有效成分差異較大，所含有效成分含量亦不同。楊氏等[66]采用HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地大黃中大黃酸的含量進(jìn)行比較，結(jié)果唐古特大黃含大黃酸最多。藥物由于提取方法不同，所提取化學(xué)成分及濃度亦不同，發(fā)揮的作用不一樣，隨著藥液濃度的變化，在反應(yīng)體系中作用的主從地位可能發(fā)生著變化，況且多種成分共存時(shí)，有時(shí)還可能發(fā)生協(xié)同或拮抗效應(yīng)。結(jié)果啟示我們，服用中藥時(shí)，亦存在藥物劑量問(wèn)題，即使同一藥物，濃度不同也會(huì)產(chǎn)生不同的效果。因此我們認(rèn)為采用ESR法觀察中藥清除O2˙作用，應(yīng)從中藥材中提取其單體成分進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能比較客觀、準(zhǔn)確的反應(yīng)其清除作用。 中醫(yī)藥的抗氧化作用雖然可分為清除氧自由基及抑制氧自由基產(chǎn)生兩個(gè)方面，但是，由于中藥復(fù)方制劑甚至單味中藥，其有效成分具有多樣性特點(diǎn)，因此，其抗氧化作用的作用機(jī)制常常是兩方面同時(shí)具備。從目前中藥抗氧化的研究報(bào)道來(lái)看：盡管不乏高水平、高難度的研究，但確實(shí)也有一些研究還停留在不太高的層次上，存在著同一水平重復(fù)研究的問(wèn)題。目前應(yīng)加強(qiáng)量效關(guān)系方面的研究；從粗提物的研究向分離單體的研究過(guò)渡；從單味藥的研究向進(jìn)行復(fù)方的研究過(guò)渡，從而使中醫(yī)藥抗氧化的研究跨上一個(gè)新臺(tái)階。 全 文 結(jié) 語(yǔ) CONCLUSION 黃中提取的主要成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚均具有一定清除O2˙的能力，大黃所具有的延緩衰老的作用，可能與其所含的主要成分清除超氧陰離子自由基（O2˙）而起到抗氧化的作用有關(guān)，該結(jié)果為大黃延緩衰老的作用提供了理論依據(jù)，并為課題“大黃腹膜透析液”降自由基的作用提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)大黃的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)和現(xiàn)代研究有機(jī)的結(jié)合了起來(lái)，為從天然產(chǎn)物中尋覓延緩衰老的有效藥物提供了一條較為簡(jiǎn)捷的途徑。但本實(shí)驗(yàn)是在體外模型中進(jìn)行的，與復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境不同，其需要考慮在病理狀態(tài)及生理狀態(tài)的不同情況下中藥的抗氧化特性的異同，如pH值、電解質(zhì)濃度、溫度以及各種酶的存在等，因此，要了解大黃的主要成分在體內(nèi)對(duì)自由基的清除情況，尚需進(jìn)一步研究，從而進(jìn)一步明確其抗氧化作用的機(jī)制，推動(dòng)中藥的現(xiàn)代化研究。 參考文獻(xiàn) [1] 李秀才．大黃的研究進(jìn)展．中國(guó)藥學(xué)雜志（J），1998，33（10）：581～584． [2] 張秋菊，張長(zhǎng)偉，江駿，等．大黃水提物的促智作用研究．中藥材（J），2001，24（10）：728～730． [3] 桑雁，韓清，王憲波，等．大黃抗衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)（J），1996，13（1）：13～15． [4] 田金洲，杜懷棠，楊惠民，等．復(fù)方大黃制劑改善老年人記憶功能的臨床研究．中醫(yī)雜志（J），1995，36（9）：545～547． [5] 肖華山，傅文慶，趙保路，等．大黃提取液對(duì)體外氧自由基清除作用的研究．福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）（J），1993，9（4）：68～72． [6] 陳季武，胡天喜．大黃清除活性氧的作用．中國(guó)藥學(xué)雜志（J），1996，31（8）：461～463． [7] 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