金銀花中綠原酸的快速測(cè)定方法 | 金銀花中綠原酸的快速測(cè)定方法 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 發(fā)布時(shí)間:2012-12-10 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):2306 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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摘 要：目的 建立金銀花主要有效成分綠原酸總量的快速比色測(cè)定方法。方法 采用酚類物質(zhì)中酚羥基與三氯化鐵的顯色反應(yīng)，對(duì)綠原酸與三氯化鐵的顯色反應(yīng)的一些特征參數(shù)，如：顯色反應(yīng)的條件、顯色產(chǎn)物的吸收波長(zhǎng)、穩(wěn)定性、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及回收率等，進(jìn)行考察與測(cè)定。結(jié)果 該顯色反應(yīng)物的檢測(cè)波長(zhǎng)為755 nm；以綠原酸的吸光度和濃度得出工作曲線，回歸方程為Y（µg/ml）＝231.77 X＋5.4114，相關(guān)系數(shù)為0.9982；綠原酸的濃度在0～181.0µg/ml范圍內(nèi)符合比耳定律，表觀摩爾吸收系數(shù)ε＝1.495×103 L·mol-1·cm-1，檢出限為3.78 µg/ml、回收率為92.22%。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)單、快速、廉價(jià)，可望用于中藥材金銀花質(zhì)量的快速檢測(cè)與評(píng)價(jià)，指導(dǎo)其生產(chǎn)實(shí)踐。 關(guān)鍵詞：金銀花；綠原酸；快速測(cè)定；比色法 金銀花綠原酸 上禾生物 中圖分類號(hào)： 656 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
金銀花(Lonicera japonica)，又稱忍冬，是常見(jiàn)中藥材之一，具有抗氧化、清除自由基、降血脂、降血壓、預(yù)防心血管病、抗突變、抑菌解毒、消炎利膽等多種藥理活性功能，其主要有效成分為綠原酸(chlorogenic acid ，CHA)[1-6]。常用的綠原酸含量的測(cè)定方法主要有紫外分光光度法（UV）、高效液相色譜（Rp- HPLC）法以及高效毛細(xì)管電泳（HPCE）法等[7-9]。本研究建立了一種既可迅速測(cè)定其含量而又廉價(jià)的快速檢測(cè)方法。 與三氯化鐵的顯色反應(yīng)，是酚類物質(zhì)的重要化學(xué)特性之一。這種特殊的顯色反應(yīng)，可以用來(lái)檢驗(yàn)酚羥基的存在[10]。初步研究表明，該反應(yīng)也可應(yīng)用于定量分析。本研究擬在此基礎(chǔ)上，對(duì)綠原酸與三氯化鐵的顯色反應(yīng)的一些特征參數(shù)，如：顯色反應(yīng)的條件、顯色產(chǎn)物的吸收光譜與穩(wěn)定性、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及回收率等進(jìn)行考察與測(cè)定，為研究、建立金銀花中綠原酸總量的快速測(cè)定方法提供參考。 1材料與方法 1.1主要儀器和試劑 主要儀器：島津UV2550型紫外分光光度計(jì)，722可見(jiàn)分光光度計(jì)， KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（功率100%）。主要試劑：綠原酸 (購(gòu)自Sigma公司，純度為95％)，顯色劑為 1.2實(shí)驗(yàn)方法 2 結(jié)果 2.1 顯色反應(yīng)原理 與三氯化鐵的特殊顯色反應(yīng)，被認(rèn)為是檢測(cè)酚類物質(zhì)的定性方法，其反應(yīng)式為6ArOH+FeCl3→[Fe (OAr)6]3- + 6H++3Cl-[10]。綠原酸也是一種酚類物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示[11]。初步試驗(yàn)表明，綠原酸與三氯化鐵的顯色反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度與綠原酸的含量呈良好的線性關(guān)系，而反映金銀花質(zhì)量的指標(biāo)性成分即為綠原酸。因此，該反應(yīng)可用于金銀花中綠原酸含量的測(cè)定。
圖1綠原酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖 2.2 最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇 鑒于綠原酸是中藥材金銀花中的主要指標(biāo)性成分[1,2,4]，因此本研究以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，顯色溶液的吸收光譜掃描、方法建立和評(píng)價(jià)均在島津UV2550型紫外分光光度計(jì)上完成。 橙黃色的FeCl3溶液可與無(wú)色透明的綠原酸甲醇溶液反應(yīng)，從而生成深綠色絡(luò)合物質(zhì)。對(duì)上述顯色方法中的空白液和試樣液進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，該顯色反應(yīng)物可見(jiàn)光范圍內(nèi)的最大吸收峰的波長(zhǎng)為755 nm。 圖2 顯色產(chǎn)物的吸收光譜 注：LU為綠原酸掃描圖譜；Fe為氯化鐵溶液掃描圖譜；LU+Fe反應(yīng)后掃描圖譜。 初步試驗(yàn)表明，該顯色反應(yīng)與反應(yīng)的時(shí)間和溫度有較大的關(guān)系，同時(shí)顯色劑FeCl3溶液的加入量也顯著影響顯色反應(yīng)的進(jìn)行。因此，在選擇、優(yōu)化顯色條件時(shí)，本研究采用三因素三水平正交試驗(yàn)方案L9（34）。正交試驗(yàn)的方案設(shè)計(jì)與結(jié)果分析詳見(jiàn)表1和表2。 表1 L9(34)正交試驗(yàn)和水平
試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，顯色劑FeCl3的用量對(duì)顯色反應(yīng)的影響較大，而反應(yīng)時(shí)間的影響較小。顯色劑用量越低，其吸光度越高，這可能是由于FeCl3在水中發(fā)生水解反應(yīng)，即：2FeCl3+6H2O→ 2Fe(OH)3+6H++6Cl-；顯然，該反應(yīng)會(huì)使溶液的酸度加大，進(jìn)而抑制絡(luò)合反應(yīng)（6ArOH+FeCl3→ [Fe(OAr)6]3-+6H++3Cl-）的進(jìn)行。因此，應(yīng)該嚴(yán)格控制顯色劑FeCl3的用量。從總的來(lái)看，各因素的最優(yōu)水平組合是 A2B1C2，即：在35℃下加入0.01M FeCl3溶液0.5 ml、反應(yīng)60 min作為試驗(yàn)條件。 表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果及其分析
2.3 反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性
圖3. 絡(luò)合產(chǎn)物隨時(shí)間變化掃描圖譜 將反應(yīng)產(chǎn)物在可見(jiàn)光光譜下進(jìn)行掃描，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，該顯色反應(yīng)產(chǎn)物生成后的前60 min還不太穩(wěn)定，其在最大吸收峰波長(zhǎng)755 nm處的吸收值大小，依次為3 min<10 min <25 min<30 min<45 min<60 min；60 min后，即：在第60、70、80和90 min時(shí)，其反應(yīng)產(chǎn)物的吸收值趨于穩(wěn)定。 2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 將 Y（µg/ml）＝231.77X＋5.4114，R2＝0.9982,ε＝1.495×
2.5 檢出限 將空白試樣在分光光度計(jì)下連續(xù)測(cè)定20次，據(jù)IUPAC計(jì)算得出其檢出限為3.78 µg/ml，RSD=3.1%。 2.6 精密度考察 對(duì)濃度為120.65 µg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測(cè)定5次，其平均值為121.99 µg/ml，RSD=0.30%。 2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 將同一供試金銀花樣品分成3份，依法測(cè)定，其綠原酸含量的平均值為2.25%，RSD=2.20%。 2.8 回收率測(cè)定 按樣品液制備和測(cè)定方法進(jìn)行定量分析，將測(cè)定結(jié)果扣除樣品中綠原酸的含量，與加入標(biāo)準(zhǔn)品量的比值，為加樣回收率。測(cè)定結(jié)果為92.22%。 2.9 應(yīng)用 應(yīng)用上述研究確定的測(cè)定方法，對(duì)購(gòu)自藥店的3個(gè)金銀花成品進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表3。 表3 金銀花樣品中綠原酸含量
3 討 論 通過(guò)上述試驗(yàn)結(jié)果可知,利用酚類物質(zhì)與三氯化鐵的特殊顯色反應(yīng)原理研究、建立金銀花主要有效成分綠原酸含量的快速測(cè)定方法是可行的。我們可根據(jù)試驗(yàn)所獲得的有關(guān)參數(shù)值將其制成便攜式小型光譜測(cè)定儀[12]，用于金銀花的生產(chǎn)實(shí)踐和市場(chǎng)流通過(guò)程中的質(zhì)量檢驗(yàn)與控制。
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第一作者：張秋芳，女，出生于1973年8月，碩士，助研。 工作單位和地址：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福州市五四路247號(hào) 郵編350003 聯(lián)系電話：13055748230 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
