橙皮苷的分離純化與分析測(cè)定 | 橙皮苷的分離純化與分析測(cè)定 | ||||||||||||||||||||||||
| 發(fā)布時(shí)間:2012-12-10 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):2110 | ||||||||||||||||||||||||
|
橙皮苷的分離純化與分析測(cè)定 一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求 1．掌握黃酮苷類的提取分離方法; 2．掌握用HPLC定量測(cè)定橙皮苷的操作方法。 二、 基本原理 橙皮苷（又稱陳皮苷或桔皮苷）臨床上常作為治療高血壓的輔助藥和止血藥。能維持血管正常滲透壓，減低血管脆性，縮短流血時(shí)間，具有類似維生素P作用；其復(fù)合劑也用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕熱。橙皮苷在許多國(guó)家已成為法定藥物。新橙皮苷、柚皮苷（又稱柚苷、柑桔苷或異橙皮苷）具有和橙皮苷類似的藥理作用,但它們結(jié)構(gòu)均不相同。柚皮苷為一新型甜味劑。因此,發(fā)掘該類成分的資源和進(jìn)行深加工具有重要意義。 我國(guó)柑桔栽培面積居世界第一，產(chǎn)量居世界第三位(柑桔皮重約占整果重20%，含有豐富的香精油、色素、果膠、橙皮苷等。近年國(guó)內(nèi)果品產(chǎn)量大幅度提高，柑桔國(guó)內(nèi)年產(chǎn)數(shù)千萬(wàn)噸，收獲季節(jié)常造成大量積壓，價(jià)格很低。柑桔除食用外，還可及時(shí)進(jìn)行各種深加工、綜合利用，既減少了果農(nóng)損失，又可提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。柑桔經(jīng)過(guò)加工可提取果汁，制備固體飲料、桔子汽水、桔子酒、果凍、果醬等，從柑桔皮中也可提取柑桔精油、色素、果膠和橙皮苷。此外還可制作果丹皮、桔子餅、藥用品等以及植物性農(nóng)藥等。柑桔落果、裂果約占柑桔總產(chǎn)量的10%左右，其橙皮苷含量十分豐富。隨品種和產(chǎn)地的不同，一般干果的橙皮苷含量約在百分之幾至百分之十幾。另外柑桔皮除入藥外，有相當(dāng)部分的桔皮未做任何處理便丟棄掉，是一種生物資源的很大浪費(fèi)。因此以柑桔落果或柑桔皮為原料，提取橙皮苷可成為橙皮苷生產(chǎn)的重要途徑之一。
橙皮苷及其類似物的結(jié)構(gòu) 橙皮苷（又稱陳皮苷或桔皮苷）為二氫黃酮苷類化合物，是橙皮素與葡萄糖和鼠李糖結(jié)合形成的苷類，為細(xì)樹(shù)枝狀針狀結(jié)晶(pH6-7沉淀所得)。Mp.258-2620C(2500C軟化)。［α］20 D-760（C=2，吡啶）。在水中溶解度為1：50000，600C時(shí)溶解于二甲基甲酰胺及甲酰胺。略溶于甲醇及熱冰醋酸，幾乎不溶于丙酮、苯及氯仿，易溶于稀堿及吡啶。 根據(jù)黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，通常用溶劑法和堿溶酸沉法提取,再利用其它方法進(jìn)一步精制。溶劑法中一般多用水或乙醇為溶劑，加熱提取，提取液再用乙酸乙酯、乙醚等萃取，除去雜質(zhì)。堿提取酸沉淀法則是利用黃酮類一般易溶于堿水、酸化后又可沉淀析出的原理提取分離。此法簡(jiǎn)便易行。如從槐米中提取蘆丁(rutin)，從黃芩提取黃芩苷均可用此法。但所用酸堿均不宜過(guò)濃過(guò)強(qiáng)，以免強(qiáng)堿在加熱時(shí)破壞黃酮，也防止在酸化時(shí)生成钅羊鹽，使析出的黃酮又復(fù)溶解，影響收得率。當(dāng)材料含有大量果膠、粘液等水溶性雜質(zhì)時(shí)，宜用石灰乳或石灰水代替堿性水液提取，以使含羧基雜質(zhì)沉淀，不致溶出。這樣有利于后續(xù)純化處理。 本試驗(yàn)以柑桔落果或柑桔皮為原料來(lái)提取橙皮苷。對(duì)橙皮苷的定量分析有庫(kù)侖滴定法、紫外分光光度法、薄層掃描法和高效液相色譜法。本實(shí)驗(yàn)原材料和精制橙皮苷中橙皮苷經(jīng)薄層鑒定后，其含量是用薄層掃描法和高效液相色譜法測(cè)定的。 三、 儀器與試劑 1．儀器：燒杯，容量瓶，硅膠薄層板，聚酰胺薄膜，濾紙，抽濾裝置，紫外燈，層析缸，雙波長(zhǎng)薄層掃描儀，薄層掃描儀，熒光分光光度計(jì)，高效液相色譜儀等 2．樣品與試劑：柑桔落果（或柑桔皮），飽和石灰水，鹽酸，槐米，硼砂，石灰乳，55％乙醇，55％乙醇(內(nèi)含2%KOH)，50%DMF溶液，橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇，1％AlCl3甲醇液，硅膠G，正丁醇∶冰醋酸∶水(4∶1∶1) 四、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟
將收集來(lái)的柑桔落果（或柑桔皮）進(jìn)行除雜，切片，低溫干燥后，粉碎。
方法一將提取果膠之后的柑桔皮粉殘?jiān)?SPAN lang=EN-US>100g置1000 mL燒杯中,加水450 mL浸泡，再加入6-8g 1：1生熟石灰混合粉［2］，慢速攪拌下浸提1h,在此期間調(diào)節(jié)保持pH值為11-12，過(guò)濾。濾渣再次用400 mL水浸泡1h，過(guò)濾，合并兩次濾液。用鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH值為4.5-5.0，在室溫下靜置過(guò)夜，使橙皮苷沉淀完全，濾取沉淀，用熱水洗滌沉淀幾次，干燥得粗橙皮苷。稱重，計(jì)算收率。 方法二 將100g柑桔落果粉置1000 mL燒杯中，用600 mL的飽和石灰水,在攪拌下加熱煮沸0.5h，在此期間用少量石灰乳調(diào)節(jié)，使pH保持-13。過(guò)濾。濾渣再次用400 mL飽和石灰水加熱提取1次。合并濾液，用HCl中和至pH4-5，熱至60-70℃，并保溫30 min，冷卻靜置1.5h，使其沉淀完全，過(guò)濾，收集固體，并用熱水洗滌，60-70℃干燥，即得淡黃色粗橙皮苷。 方法三 將100g柑桔落果粉置1000 mL燒杯中，用800 mL的飽和石灰水常溫下(20℃)攪拌浸提1.5h，在此期間適當(dāng)添加少量石灰乳，使pH保持為11-12。過(guò)濾，濾渣再次用400 mL飽和石灰水攪拌浸提1h。合并濾液，用HCl中和至pH4-5，熱至60-70℃，并保溫15 min，冷卻靜置1.5h，使其沉淀完全，過(guò)濾，收集固體，并用熱水洗滌，60-70℃干燥，即得淡黃色粗橙皮苷。 方法四 取橙皮粗粉100g，加300 mL55％乙醇回流提取1.5h，過(guò)濾。殘?jiān)儆?SPAN lang=EN-US>200 mL提取1次。合并濾液，減壓蒸餾回收乙醇,至總體積1／2。趁熱過(guò)濾，濾后靜置2h，待其沉淀完全。過(guò)濾得沉淀物，少量水洗后，低溫下干燥得粗制橙皮苷，稱重，計(jì)算收率。
方法一 加55％乙醇(內(nèi)含2%KOH)堿性溶液溶解,濾除不溶物，濾液加稀HCl中和，析出沉淀，收集后用適量乙醇重結(jié)晶，得橙皮苷白色結(jié)晶。稱重，計(jì)算產(chǎn)率。 方法二將粗橙皮苷置于50%DMF溶液中，在50-600C下加熱回流，趁熱過(guò)濾,濾液靜置12h，析出晶體，過(guò)濾，將晶體在600C下烘干，即可得淡白色純品，稱重，計(jì)算產(chǎn)率。
儀器及測(cè)試條件: 島津CS-910型雙波長(zhǎng)薄層掃描儀；反射法鋸齒形掃描，λS =280nm，λR =400nm；掃描速率20 mm/min，紙速20 mm/min，狹縫1.25 mm×1.25 mm，記錄儀靈敏度×1，散射參數(shù)SX為3。 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品配成0.50 mg/ mL甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取2.00-10.00μL一系列標(biāo)準(zhǔn)液，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑為正丁醇∶冰醋酸∶水(4∶1∶1)，飽和半小時(shí)后上行法展開(kāi)，揮干溶劑，即在365nm紫外燈下定位，按上述儀器條件測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)其積分值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得回歸方程為[3]：Y＝0.0436X+0.0258，ｒ＝0.998. 樣液制備［4］：精密稱取原料樣品粉末0.1000-0.5000g，用20 mL甲醇在800C水浴中超聲波萃取30 min,小心轉(zhuǎn)移提取液，殘?jiān)?SPAN lang=EN-US>15 mL甲醇在800C水浴中超聲波再萃取1次，過(guò)濾，少量甲醇洗殘?jiān)�，合并濾液定容至50 mL。如果測(cè)定精制品中橙皮苷含量,則需稱取精制品0.02-0.01g,用15 mL甲醇在800C水浴中超聲波促溶30 min,然后定容至50 mL即可。 樣液測(cè)定[5]： 精確吸此甲醇液6.00μL，標(biāo)準(zhǔn)液3.00μL、5.00μL，分別點(diǎn)于板上，同前操作并掃描，用外標(biāo)二點(diǎn)法求橙皮苷含量。計(jì)算公式如下： (M1+M2)×Ax/2 Mx＝ ----------------- (A1+A2)/2 M1,M2分別為標(biāo)準(zhǔn)液3.00μL，5.00μL中含橙皮苷毫克數(shù)，Ａ1，Ａ2分別為其液點(diǎn)相應(yīng)積分值。Ａx為供試品斑點(diǎn)積分值. 樣品中橙皮苷百分含量(%)＝(Mx/6.00×5 0×1000)/[(0.1-0.5)×１０５] 本法加樣回收率為99.5%，CV3.8%
儀器條件：CS-930薄層掃描儀(日本島津)，MPE-4-型熒光分光光度計(jì)(日本)。熒光法線性掃描；激發(fā)波長(zhǎng)306nm，發(fā)射波長(zhǎng)500nm(系經(jīng)熒光分光光度計(jì)測(cè)得后擬定)，狹縫0.05 mm×5 mm，ΔY=0.2 mm。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取橙皮苷對(duì)照品適量，以甲醇作溶劑制成0.5 mg/ mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用微量注射器分別吸取1、2、3、4、5μL,小心點(diǎn)于一張聚酰胺薄膜上，以甲醇展開(kāi),取出，晾干，噴以1%三氯化鋁的甲醇溶液顯色后，在紫外燈下定位，然后按上述儀器條件進(jìn)行掃描測(cè)定。以測(cè)得此峰面積對(duì)橙皮苷的量(μg)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線�；貧w方程為［3］：C＝0.0016Ａ-1.3171，ｒ＝0.9991。 樣液制備：按步驟4中方法制備。 樣品測(cè)定［6］：精確吸取5μL和對(duì)照品溶液1μL，3μL,5μL小心點(diǎn)于一張聚酰胺薄膜上，以甲醇展開(kāi)，展開(kāi)后取出晾干，噴1%三氯化鋁的甲醇溶液，于紫外燈下定位，放置3h(3-8h內(nèi)斑點(diǎn)穩(wěn)定)，然后掃描，由標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀取橙皮苷的量，或根據(jù)回歸方程進(jìn)行計(jì)算。 本法加樣回收率為99.9%±2.13%。
儀器及測(cè)定條件：島津LC-4A高效液相色譜儀，DEVELOSIL ODS-7柱(4.6 mm×300 mm)。流動(dòng)相：乙腈-水-磷酸(180∶820∶0.1)；流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，柱溫：40℃。 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取橙皮苷樣品0.0443 mg，甲醇溶解，定容至100 mL，吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液2，4，6，8，10μL進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC測(cè)定，以進(jìn)樣量與峰面積作回歸處理得方程[2]： Y＝3.02×106Ｘ＋3.702×104,ｒ＝0.9991 樣液制備：按步驟4中制備,但溶液最后須經(jīng)0.45μm微孔濾器過(guò)濾，即得供試樣液， 樣品測(cè)定：取10μL樣液進(jìn)行HPLC測(cè)定，將測(cè)得的A峰(21 min)面積代入回歸方程，得出供試樣液中橙皮苷含量，并計(jì)算樣品中橙皮苷含量。 本法加樣回收率為100.69%，RSD為0.84%。 注釋 1．本實(shí)驗(yàn)中提供了數(shù)個(gè)提取方法，可根據(jù)不同原料選用合適的提取方法。 2．生、熟石灰混合粉中含有一定數(shù)量不溶性CaCO3，其顆粒表面吸附有Ca2+而帶正電荷，可以吸附蛋白質(zhì)和果膠質(zhì)而凝聚，以免生成膠體，有利于過(guò)濾。pH11-12是堿性體系中蛋白質(zhì)、果膠質(zhì)和其它膠質(zhì)的最佳凝聚點(diǎn)，并且在此時(shí)橙皮苷能較好地變成查耳酮型結(jié)構(gòu)而溶于提取液，有利于橙皮苷提取， 3．實(shí)際在測(cè)定時(shí)需要根據(jù)當(dāng)時(shí)儀器和其它條件實(shí)時(shí)測(cè)定并重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。此處回歸方程僅供參考，不能套用。 4．在定量分析試驗(yàn)中，樣液制備過(guò)程中采用的提取方法要比一般提取過(guò)程效率要高，溶出速度要快一些，有利于節(jié)約測(cè)定時(shí)間。 5．若樣品含柚皮苷，TLC可將其與橙皮苷分開(kāi)，對(duì)分析結(jié)果無(wú)干擾；另外標(biāo)準(zhǔn)品在1-4μL范圍內(nèi)積分值與樣品量呈線性關(guān)系，故定樣量應(yīng)控制在直線性范圍以內(nèi)。 6．若樣品有黃芩苷，它與橙皮苷結(jié)構(gòu)近似，在紫外光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)相近，吸收峰重疊，在上述分離條件下，黃芩苷留在原點(diǎn)，橙皮苷Ｒｆ值約為0.7,兩者可完全分離，不影響測(cè)定。 思考題 1． 一般的分光光度法測(cè)定黃酮和本實(shí)驗(yàn)中所用的薄層掃描法定量測(cè)定有何異同點(diǎn)？ 試比較本實(shí)驗(yàn)中所采用的4種提取橙皮苷方法的優(yōu)缺點(diǎn)。 |
