利用LC／MS檢測中藥總成分中各大類成分含量的方法學探討 | 利用LC／MS檢測中藥總成分中各大類成分含量的方法學探討 |
| 發(fā)布時間:2012-12-11 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):2645 |
中藥作為復雜體系，其中有多種成分共同協(xié)調(diào) 而起作用。中藥的多成分、多靶點的特點已是其所不 同于其它藥物的關(guān)鍵之處。研究中我們發(fā)現(xiàn)，一個藥 物，隨著成分的分離越來越細，其活性也隨之降低， 往往到最后單一成分時，其所表現(xiàn)的活性反不如原 來的總成分。因此，多數(shù)情況下，中藥的活性組成單 元應該是以總成分為主。這也是中藥所不同于其它 化學藥物的重要之處。中藥新藥的研發(fā)過程中．對其 有效部位(各大類成分)的分離純化以及其后的質(zhì)量 控制應為現(xiàn)代中藥的重點之一。 總成分的測定常常以某一對照品為參照，在某一特定波長下測定并計算其含量。盡管這一方法不 盡人意：存在著專屬性和易受其它成分干擾的問題， 尤其是多個大類成分混合在一起時，更是如此。但是 到目前為止，仍沒有較好的方法可以替代。以高效液 相色譜(HPLC)方法，通過柱層析原理將各類成分分 離，并由此可以清晰的累積各成分峰進而計算總成 分含量。但是這里存在一個重要的問題是每一個成 分峰的對照品如何獲得。由于洗脫時間的不同和各 成分紫外響應的不同，以某一對照品的對應峰面積 來計算不同成分峰的含量是不準確的 理論上講． HPLC所分離的每一峰都應有一相應的對照品來對 應，這樣所計算的含量才是準確的。但這種可行性較 小。關(guān)鍵在于我們拿不到足夠多的對照品，同時也沒有必要。針對這一問題，有人以總指紋圖譜加上特定 成分含量來從定性定量兩方面做總體質(zhì)量控制f】】。由 于紫外分光光度法(uv)是在某一特定波長下對總成 分進行測試，不可避免會有一些成分的非特異性干 擾，如果利用液相一質(zhì)譜(LC—MS)將各成分分離，并 從結(jié)構(gòu)上對其進行大類歸屬，再計算百分含量，這樣 就可以避免了UV測定中的相互干擾。鑒于此，我們 以感冒藥YL2000為例．進行了方法學研究。 YL2000主要由黃連、黃芩、獨活和羌活組成。主 要含有生物堿、黃酮和香豆素三大類成分�？诜笤� 藥復雜體系中的各大類成分都存在于體內(nèi)[2-4]。利用 LC—MS技術(shù)對YL2000各大類含量及其總含量進行 有效測試，對于總成分測定的方法學探討具有重要 的理論意義。 一 、材料與方法 1．儀器、試劑與藥品 Agilent 1100 HPLC 高效液相色譜儀fAgilent Technologies，USA)， 電噴霧ESI質(zhì)譜儀(Agilent G2440A MSD-Trap—XCT ion trap mass spectrometer)， Kromasil～C 1 8 HPLC 色譜柱f5m particle size silica， 150 mm x 4．6 lllm I．D．．Rainbow，Beijing)。YL2000原 料藥，批號060401，由海南養(yǎng)生堂制藥公司提供。黃 芩苷，批號715—200010；鹽酸小檗堿，批號0713— 9906；蛇床子素，批號0822—9802。以上對照品均購自 中國藥品生物制品鑒定所。 2．色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充相，乙腈(A)一 0．4％甲酸水(B)溶液為流動相，采用梯 度洗脫方法，梯度設置為：0～60min，A： l0％ — 40％ ，B：90％ —_+60％ ； 60 ～ 100min，A：40％ — 65％ ，B：60％ —}35％ ； 100 ～110min，A：65％ ，B：35％ ：1l0 ～ 120min，A：65％ — 90％ ， B：35％ 10％ 。流速lml／min，柱溫25℃ 。 3．質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件：調(diào)諧：霧化氣28psi。干 燥氣流速7L／rain，干燥氣溫度350℃ ，目標質(zhì)量900，化合物穩(wěn)定性80％ ，離子肼驅(qū)動水平 60％。自動質(zhì)譜／質(zhì)譜參數(shù)：強度閾值5 000，母離子數(shù) 2，分離寬度2．0，碰撞能量1．00，m／z 100—1000。 4．對照品溶液的制備 精密取黃芩苷對照品5．3rag，鹽酸小檗堿4．5rag， 蛇床子素2．4mg置25mL容量瓶中，加甲醇20mL， 30cC超聲30rain使其溶解，加甲醇定容，搖勻，即得。 5．供試品溶液的制備 精密稱定供試樣品約20mg，置25mL容量瓶中， 加80％乙醇20mL，30~C超聲30min使其溶解，加80％ 乙醇定容，搖勻，靜置。取上清液用微孔濾膜(直徑 0．45Ixm)濾過，取續(xù)濾液，即得。 二、結(jié)果與討論 1．各類成分含量 分別精密吸取對照品溶液10 l，供試品溶液 201xl注入液相色譜儀，按照上述色譜條件進行洗脫， 得到總離子流色譜圖，分別對各個峰進行積分，計算 各峰對應總峰面積的相對百分含量，以對照品的峰 面積為標準，按照一點法分別計算黃芩苷、小檗堿、 蛇床子素的含量(見表1)。 2．各大類成分含量的比對和計算 籠統(tǒng)的以總離子流色譜圖的面積比無法表征各 類化合物的真實含量，根據(jù)文獻可知，黃連中的小檗 堿類生物堿，黃芩中的黃芩苷類黃酮以及蛇床子素 等香豆素分別與小檗堿[ 、黃芩苷[61、蛇床子素}7l具有 相似的裂解方式和響應值，而黃芩苷、小檗堿和蛇床 子素的含量均通過高效液相色譜一紫外檢測(HPLC一UV)進行測定。因此，參考文獻[83我們分別以小檗堿、 黃芩苷和蛇床子素含量為標準，估算對應的總生物 堿、總黃酮和總香豆素的含量，計算公式為： 總黃酮％ =黃芩苷實測值％×總黃酮LC—MS％ ／ 黃芩苷LC—MS％ ： 總生物堿％ =小檗堿實測值％ ×總生物堿LC— MS％ ／小檗堿LC—MS％ ： 總香豆素％ =蛇床子素實測值％ ×總香豆素 LC—MS％ ／蛇床子素LC～MS％。 計算得到各總成分含量見表2。 3．兩種計算方法的對比 在計算各大類成分含量時，所用對照品是其關(guān) 鍵要點 從測試的吻合度來說，應該以LC—MS所得 的各單體成分含量為參照，來計算各大類成分含量。 但從表l來看，LC—MS所得各單體含量與HPLC所 測含量有所出入，這表明不同的測試條件和方法，對 其含量有一定影響。為了從多方面來證實各大類成 分含量．我們又以HPLC—UV所測各單體含量為參 照、分別對各大類成分含量進行了計算。從表2的結(jié)果來看．HPLC—UV計算結(jié)果與LC—MS計算的結(jié)果 基本一致，總成分含量分別為58．83％和58．5％。表明 這兩種測試方法對于各大類成分的含量計算影響不 大。盡管各自的色譜條件不同，其色譜峰的保留時間 不同，但由于在各自的色譜條件下均相應的對照品 來作外標計算，因此其含量是恒定的。以此各單體成 分的含量作為參照，對LC—MS中所得各大類成分百 分含量做計算，所得結(jié)果也是可信的。這種方法的優(yōu) 點是，在同一樣品的前提下，以HPLC—UV測試的各 單體成分含量為參照，根據(jù)LC—MS各成分裂解規(guī)律 所得的各大類成分的構(gòu)成比、來直接計算各大類成 分含量 如此只需在LC—MS上進行一次半定量測 試，無需在LC—MS上測試各單體含量。省去了許多 的諸如標準曲線等方法學的工作。而這些工作可以 在HPLC—UV上進行，同時還節(jié)省了LC—MS上的費 時操作，而且也較為經(jīng)濟。 4．LC—MS與UV方法所得總成分含量的比較 采用紫外分光光度法(UV)測定總成分得到的結(jié) 果與LC—MS得到的總成分結(jié)果差別不大，尤其是總 黃酮和總生物堿的相對差別都較小，說明采用UV方 法測定總黃酮和總生物堿的專屬性較好，簡單可行； 總香豆素相對差別較大，這主要是由于香豆素類成 分極性較小，LC—MS測試時柱溫采用的是室溫，而 HPLC—UV測試時柱溫是5O℃ ，其洗脫效果會受到一 定的影響，會有部分香豆素死吸附。因此，可以認為 LC—MS測定的總香豆素含量比UV方法測得含量偏 低屬正�，F(xiàn)象。同時，兩種方法測定的總黃酮、總生 物堿和總香豆素的含量之和差別較小，相對誤差為 4％。各方法所得各大類成分占總成分的構(gòu)成比具有 相同的趨勢(參見圖1)，由此表明，LC—MS測試的各 大類成分與UV所測各大類成分結(jié)果應該是一致的， 同時也進一步印證UV方法用于總成分的含量測定 具有較好的專屬性，測定結(jié)果是準確的可靠的。 三、結(jié)論 中藥的有效部位可能是其藥效作用的物質(zhì)核 心，因此對中藥各大類成分的測定和質(zhì)量控制是中 藥的必不可少的內(nèi)容�，F(xiàn)有的紫外可見分光光度測定方法仍然是大類總成分測定的主要技術(shù)。由于是 以一個單一成分含量作參照測定，因此總成分含量 是一個相對值。利用LC—MS測定各類成分結(jié)構(gòu)歸 屬，可以避免分光光度法測試時各類成分間的非特 異性干擾，是一個值得探討并加以完善的方法。 |
