六味地黃湯相關(guān)單體對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)PPARδ水平的影響 | 六味地黃湯相關(guān)單體對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)PPARδ水平的影響 |
| 發(fā)布時(shí)間:2012-12-13 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):2684 |
| PPAR3(peroxi—some proliferator activated re— ceptor)是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)的 3個(gè)亞型之一。在胰島、心肌、骨骼肌、脂肪組織、皮膚、腦組織中均有較高表達(dá)。近年來(lái)的研究表明，其在肌肉、脂肪等組織的脂肪酸氧化過(guò)程中，不但發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，而且與胰島素的敏感性有關(guān)，如 PPAR8激動(dòng)劑喂養(yǎng)的肥胖鼠可以減少脂肪沉積并改善胰島素的敏感性[1 ]。六味地黃湯的現(xiàn)代藥理研究表明，其具有調(diào)節(jié)糖代謝、調(diào)節(jié)免疫功能、對(duì)抗多種損傷、穩(wěn)定細(xì)胞膜等多種作用，且能增加肝糖原含量，降低肝葡萄糖一6一磷酸酶活性[3]，降低糖尿病動(dòng)物的血糖、血脂、游離脂肪酸[4]，還具有抗氧化、清除自由基[5 等作用。而關(guān)于六味地黃湯單體成分對(duì)PPAR作用的研究至今尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者通過(guò)建立HepG2(人肝癌細(xì)胞)細(xì)胞高脂模型，降低PPAR 的水平，再給予六味地黃湯相關(guān)單體成分芍藥苷、沒(méi)食子酸、丹皮酚、梓醇、錢(qián)苷、莫諾苷、桃葉珊瑚苷、23一乙酰澤瀉內(nèi)酯醇B、薯蕷皂苷元，考察各單體對(duì)PPAR 的作用。 1 儀器與材料 1．1 儀器超凈工作臺(tái)(蘇州艾可林凈化設(shè)備有限公司)；IX71倒置熒光相差顯微鏡(日本Olympus公司)；BB16型二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)Hearous公司)； HH_4數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)；1K15 高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)；XW-80A 旋渦混合器 (上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；NOVAPHTHTM 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Luminoskan Acsent型微孔板測(cè)讀儀 (美國(guó)Thermo Scientific公司)；BS210S電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；Forma一86℃超低溫冰箱(美國(guó) Thermo公司)；-20℃冰箱(青島海爾公司)。 1．2 細(xì)胞 HepG2(美國(guó)ATCC)。 1．3 藥物與試劑 芍藥苷、沒(méi)食子酸、丹皮酚、梓醇、馬錢(qián)苷、莫諾苷、桃葉珊瑚苷、23-乙酰澤瀉內(nèi)酯醇B、薯蕷皂苷元(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98 9／6，均用DMSO 配成10 mol·L一，微孔濾膜過(guò)濾，再用培養(yǎng)基配成1O_。， 10 和10 mol·L )，由中國(guó)藥科大學(xué)天然藥化教研室提供；DMEM(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清(FetBovine Serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、EDTA、二甲基亞砜(DMSO)、碳酸氫鈉、氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均為分析純，購(gòu)自南京化學(xué)試劑一廠；脂肪乳注射液；PPA EUSA試劑盒(武漢優(yōu)爾生物技術(shù)有限公司)。 2 實(shí)驗(yàn)方法 2．1 細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)在含1O 胎牛血清的培養(yǎng)基中、100 U·n 青霉素、IO0 -n訌『鏈霉素的DMEM(高糖)培養(yǎng)基(pH7．2～7．4)中，置 37℃、體積分?jǐn)?shù)5 CO：培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，每1～2 d換液1次。3～4 d細(xì)胞融合時(shí)傳代，棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，PBS沖洗1～2遍，2．5 g·L 胰酶消化至部分細(xì)胞卷縮，加少許含1O 胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，用吸管吸取培養(yǎng)液輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液，離心，將細(xì)胞重懸于含1O 胎牛血清的培養(yǎng)基中，以1×1O 個(gè)細(xì)胞·mL 接種入新培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)與傳代。實(shí)驗(yàn)選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。 2．2 細(xì)胞高脂模型的建立及給藥[6-7] HepG2生長(zhǎng)到80 后，用2．5 g·L 胰酶消化，離心，重懸形成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞吹散均勻接種到6孔板，細(xì)胞濃度 1×10 個(gè)·mL～ ，每孔2 mL；細(xì)胞培養(yǎng)24 h貼壁后，棄上清，將細(xì)胞分為高脂模型組，高脂模型+待篩藥物組；其中所有模型組加入200肛L脂肪乳注射液，給藥組的藥物量為200 L，藥物濃度見(jiàn)表1所示；剩下的體積用含血清的DMEM 補(bǔ)齊至2 mL；給藥24 h后，用PBS洗5遍，以去掉未吸收的脂肪乳，每次2 rain，之后加200肚L細(xì)胞裂解液，置于冰上片刻后，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞及碎片，轉(zhuǎn)移裂解液及碎片入 1．5 mL的doff管中，4℃ ，12 000 r·min 離心10 min，取上清，BCA定蛋白，做ELISA時(shí)用。 2．3 ELISA 法測(cè)定各組RRAP 的質(zhì)量濃度 按照 PPAR6 ELISA 試劑盒，9種單體成分各3個(gè)濃度 (10～ ，10 和10 tool·L )加到hepG2高脂模型中，按步驟進(jìn)行檢測(cè)。 2．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用z土S表示，用SPSS 11．5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差分析。 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3．1 量效曲線 按照ELISA 法項(xiàng)下操作，以A 值的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y一2．052 2X+4．031 6(r一0．992 8)。 3．2 各單體對(duì)PPAR8水平的影響 丹皮酚、薯蕷皂苷元、桃葉珊瑚苷3個(gè)單體在不同質(zhì)量濃度下使 PPAR 都有明顯的增加，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)，其他PPAR8水平。見(jiàn)表1。 4 討論 PPAR激動(dòng)劑作為一類(lèi)2型糖尿病治療藥物開(kāi)發(fā)，其可影響心血管危險(xiǎn)因子。PPAR雙通道激動(dòng)劑可降糖、降脂及預(yù)防心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，減少胰島 細(xì)胞內(nèi)的三酰甘油沉積，降低胰島素分泌，可能防止長(zhǎng)期高脂條件下的胰島 細(xì)胞功能耗竭。姜友昭等 發(fā)現(xiàn)PPAR3能夠促進(jìn)胰島 細(xì)胞的脂肪酸氧化，增強(qiáng)胰島 細(xì)胞的脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸氧化利用、減少胰島口細(xì)胞內(nèi)的三酰甘油沉積，從而減輕胰島I9細(xì)胞的脂毒性。嚙齒類(lèi)動(dòng)物骨骼肌中PPAR3活性表達(dá)可增加工型／Ⅱ型肌纖維比例，使肌纖維中參與脂肪酸氧化、線粒體內(nèi)氧化呼吸和肌纖維慢收縮等物質(zhì)的相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)[9]，工型肌纖維比例增加，可增強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)耐力，促進(jìn)骨骼肌脂肪酸氧化，避免過(guò)多的脂肪沉積在脂肪細(xì)胞而增加體質(zhì)量，對(duì)預(yù)防肥胖和改善胰島素抵抗有重要的意義。 有關(guān)六味地黃湯全方降糖、降脂研究頗多，相關(guān)單體降脂作用研究較少。研究表明，在兔、大鼠等多種實(shí)驗(yàn)性AS動(dòng)物模型中，丹皮酚均能降低模型動(dòng)物血清中總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)水平_1 ，具有改善血液流變學(xué)、降低脂質(zhì)、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等作用口 。馬海英等口 刪實(shí)驗(yàn)證明，給大鼠灌胃薯蕷皂苷元和黃山藥總皂苷，均能明顯降低血中膽固醇含量，而薯蕷皂苷元的絕對(duì)劑量?jī)H為黃山藥總皂苷的1／2，說(shuō)明薯蕷皂苷元抗高膽固醇血癥的作用優(yōu)于黃山藥總皂苷，薯蕷皂苷元預(yù)防和治療高膽固醇血癥的作用機(jī)制為：薯蕷皂苷元的極性和空間結(jié)構(gòu)與膽固醇極為相似，因此在腸道中可以同膽固醇一樣在膽汁酸作用下分散成薯蕷皂苷元咬粒直接被腸黏膜吸收。當(dāng)薯蕷皂苷元與膽固醇同時(shí)存在時(shí)，薯蕷皂苷元競(jìng)爭(zhēng)性與膽汁酸作用從而抑制膽固醇的吸收。臨床證明，薯蕷皂苷元(維奧欣)具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善血液流變學(xué)作用，明顯降低血清總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白和氧化修飾低密度脂蛋白含量，降低高、低切變率下的全血黏度以及血漿黏度，因此可減輕動(dòng)脈壁脂質(zhì)浸潤(rùn)及斑塊形成，從而防治動(dòng)脈粥樣硬化。桃葉珊瑚苷治療后，糖尿病大鼠的一般狀態(tài)和體質(zhì)量在一定程度上恢復(fù)，血糖值和脂質(zhì)過(guò)氧化程度較未治療的糖尿病大鼠明顯降低，抗氧化酶的活性有所提高，機(jī)體抗氧化能力得到回升[】 。HepG2細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞株，來(lái)源于肝臟又基本保留了正常肝細(xì)胞的基本生物特性，其表面表達(dá)高親和力的胰島素受體，滿(mǎn)足典型胰島素受體所要求的標(biāo)準(zhǔn)[1引，包括葡萄糖攝取、糖原合成酶的活性、脂類(lèi)生成及RNA的合成，是研究肝胰島素抵抗的理想細(xì)胞模型_l 。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)所建立的HepG2細(xì)胞高脂模型研究六味地黃湯相關(guān)單體成分對(duì)PPAR 水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹皮酚、薯蕷皂苷元、桃葉珊瑚苷能明顯地增加 PPAR 的水平。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道，沒(méi)食子酸對(duì) PPART有很好的激動(dòng)作用，但對(duì)PPAR 激動(dòng)作用不明顯L1 ，本實(shí)驗(yàn)中也未見(jiàn)明顯作用；對(duì)于其余單體，尚未見(jiàn)有降糖、降脂的研究，在本實(shí)驗(yàn)中，它們對(duì) PPAR8的激動(dòng)作用也不明顯。 |
