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 l 儀器與試藥

 1．1 儀器

 Sartorius BP211D型電子分析天平(德國)，F(xiàn)w177型 中草藥粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)，Waters2690 高效液相色譜儀，Waters996二極管陣列檢測器，Millenni— urn32色譜工作站，H66O25T型超聲清洗儀。

 1．2 試藥

 杜仲原藥材購自西安市藥材市場，經(jīng)陜西中醫(yī)學院中 藥教研室王繼濤教授鑒定為杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliv．)的干燥樹皮 綠原酸對照品(購于中國藥 品生物制品檢定所，批號：0753—200111)。流動相所用甲醇 為色譜純，水為重蒸水(實驗室自制)，鹽水均為2％的食鹽 水溶液，磷酸等其它試劑均為分析純。

 2 方法與結(jié)果

 2．1 不同炮制品的制備

 杜仲生品的制備：將杜仲除去粗皮，洗凈潤透，用切藥 刀切成3~4mm的橫絲(垂直于膠絲的生長方向)。

 不同炮制品的制備：

 清炒法：取100g杜仲絲置炒制容器內(nèi)，中火炒至顏色加深，有焦斑，絲易斷時，取出晾涼。

 鹽炒制1：取100g杜仲絲，置容器內(nèi)加鹽水拌勻，加蓋 悶潤。待鹽水被吸盡后，置炒制容器內(nèi)，中火炒至顏色加 深，有焦斑，絲易斷時，取出晾涼。

 鹽炒制2：取lOOg杜仲絲，置炒制容器內(nèi)，中火炒至顏 色加深，有焦斑，絲易斷時，取出，噴淋鹽水拌勻，再置炒制 容器內(nèi)炒干，取出晾涼。

 鹽制砂炒1：將河砂置鍋內(nèi)炒至靈活狀態(tài)后，取用鹽水 悶潤好的杜仲絲100g傾人鍋內(nèi)，中火反復翻炒20min，取 出晾涼。

 鹽制砂炒2：將專用溫度計置入鍋內(nèi)，放入適量細砂， 將100g杜仲絲置入鍋內(nèi)，中火反復翻炒20min后取出，篩 去細砂，噴淋鹽水拌勻，再置炒制容器內(nèi)炒干，取出晾涼。

 鹽蒸制：取100g杜仲絲，置容器內(nèi)加鹽水拌勻，加蓋悶 潤。 待鹽水被吸盡后，置鍋內(nèi)中火蒸制1h，取出晾涼。

 2．2 色譜條件

 色譜柱：Welch Materials C18(4．6ramX250mm，5p．m)； 流動相：甲醇一O．4％磷酸溶液(25：75)；柱溫：25℃ ；檢測波 長：327nm；流速：1mL·min ；進樣量：1％I

 2．3 對照品溶液的制備

 取綠原酸對照品，精密稱定，加甲醇溶解、定容，制成每 1mL含綠原酸0．406mg的對照品溶液，備用。

 2．4 供試品溶液的制備

 取上述不同炮制品粉末各1g，精密稱定，置于三角瓶 內(nèi)，精密加入甲醇25mL，稱重，超聲lh，取出，用甲醇補足 缺失量，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

 2．5 線性關系考察

 精密吸取綠原酸對照品溶液1mL，置10mL量瓶中，加 甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取8、10、12、14、16、18、 20 L，按2．2項下的色譜條件測定。以進樣量( g)為橫坐 標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為：y一 3174278．9899X+1505．6609(r一0．9996)，結(jié)果顯示，綠原酸對照品在0．324~0．812~g范圍內(nèi)線性關系良好。

 2．6 穩(wěn)定性試驗

 取同一供試品溶液，按上述色譜條件，分別于0、2、4、 6、8、10、12h進樣10gL，測定綠原酸的峰面積。結(jié)果表明， 供試樣品在12h內(nèi)峰面積穩(wěn)定，RSD為1．62 。

 2．7 精密度試驗

 取同一供試品溶液IO／~L，按上述色譜條件，連續(xù)進樣5 次，測定綠原酸的峰面積。結(jié)果表明，精密度良好，RSD為 0．97 。

 2．8 重復性試驗

 取同一樣品共5份，照“供試品溶液制備”項下的方法 制備供試品溶液，按上述色譜條件，測定綠原酸的峰面積。 結(jié)果表明，本方法重復性良好，RSD為0．59 。

 2．9 加樣回收率試驗

 取已知含量的樣品6份，精密加入一定量的綠原酸對 照溶液，照“供試品溶液制備”項下的方法制備供試品溶液， 按上述色譜條件，取1O“L注入液相色譜儀，測定綠原酸的 峰面積，計算回收率。結(jié)果表明，綠原酸的平均回收率為 99．92 ，RSD為1．68 。結(jié)果見表l。

 2．1O 樣品的含量測定

 分別吸取各供試品溶液10ttL，注入液相色譜儀，按2．2 項下的色譜條件測定，記錄峰面積，由回歸方程計算綠原酸 的含量，結(jié)果見表2，對照品及樣品HPLC色譜圖見圖1。

 結(jié)果表明：不同炮制樣品中，綠原酸含量：鹽蒸制>鹽制 砂炒2>鹽炒制2>鹽制砂炒1>鹽炒制1>清炒>生品。

 3 討論

 (1)流動相的選擇，通過對乙腈一不同濃度磷酸溶液系 統(tǒng)，及其乙腈一磷酸溶液不同比例的洗脫系統(tǒng)進行考察，最 終選擇甲醇一0．4 磷酸溶液(25：75)出峰較為理想，可達 到基線分離。

 (2)對于檢測波長的選擇，進行了全波長掃描，綠原酸選用327nm，系統(tǒng)穩(wěn)定性好，干擾小。

 (3)通過對不同炮制方法對杜仲中有效成分影響的實 驗研究，結(jié)果表明，生品的綠原酸含量明顯低于各炮制品， 這可能是由于生品杜仲中橡膠絲的作用使其有效成分難以 溶出，這為傳統(tǒng)的“炒斷絲”炮制標準提供了理論依據(jù)。

 (4)鹽制杜仲中綠原酸的含量普遍高于清炒法和生品， 這為鹽制入腎的傳統(tǒng)用藥理論提供了科學依據(jù)。

 (5)通過對不同鹽制杜仲方法的比較，結(jié)果表明，砂炒 杜仲中綠原酸的含量高于不加砂的炮制方法，這可能是由 于砂可以提高炒制溫度，傳熱也比較均勻，進而提高了杜仲 的斷絲率所致。

 (6)鹽蒸制杜仲中綠原酸的含量最高，但是否優(yōu)于傳統(tǒng) 的炒制法，還有待于進一步研究。