迷迭香提取物含有酚性二萜類鼠尾草酸及其衍生物鼠尾酚，由于高抗氧化活性，因此，越來越廣泛的應(yīng)用在產(chǎn)品之中，來延長保質(zhì)期。我們在此描述了鼠尾草酸的完整生物合成途徑及其在酵母細胞中的重組。迷迭香和鼠尾草中的細胞色素P450加氧酶（CYP76AH22-24）能產(chǎn)生11-羥基鐵綠酚，通過鑒定該酶為鐵綠酚合成酶。丹參的鐵銹醇合酶（CYP76AH1）中，三種氨基酸基于模型的突變體可以將其轉(zhuǎn)化為11-羥基鐵銹醇合酶（HFS）。由相關(guān)的CYP76AK6-8催化，通過三次連續(xù)C20氧化，從而將11-羥基鐵綠酚轉(zhuǎn)化為鼠尾草酸。酚二萜類化合物具有強大的抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性，因此，鼠尾草酸生物合成基因的可利用性為酚二萜類化合物的代謝工程提供了機會。
雜志名：nature communications.2016,12942 . https://doi.org/10.1038/ncomms12942
英文題目：Elucidation of the biosynthesis of carnosicacid and its reconstitution in yeast
作者：Ulschan Scheler,Wolfgang Brandt, Andrea Porzel, Kathleen Rothe, David Manzano, DraganaBozˇic,Dimitra Papaefthimiou, Gerd Ulrich Balcke, Anja Henning, Swanhild Lohse,Sylvestre Marillonnet,Angelos K. Kanellis, Albert Ferrer& Alain Tissier
單位：細胞和代謝生物學(xué)系，萊布尼茨植物生物化學(xué)研究所，德國; 植物代謝和代謝工程項目，農(nóng)業(yè)基因組學(xué)研究中心，西班牙
紫杉醇和青蒿素等三萜類藥物已成為癌癥和傳染病治療中不可或缺的藥物。此外，從迷迭香（迷迭香屬藥用植物）和各種鼠尾草屬植物（鼠尾草屬植物）中提取的酚類labdane型二萜類化合物鼠尾草酸（CA）、鼠尾酚（CO）和豆酸（PA；圖1）也屬于萜類化合物的大家族。具有抗氧化、抗癌、抗炎和抗微生物等特性。CA被認為是一系列二萜類化合物的前體，包括丹參中的丹參酮，它們的抗癌活性正被積極研究。生物合成的第一個關(guān)鍵步驟是由萜烯合酶 copalyl 二磷酸合酶 (CPS) 和miltiradiene 合酶 (MiS)催化的。CPS和MiS分別將香葉基香葉基二磷酸（GGPP）環(huán)化為棕櫚酰二磷酸，棕櫚酰二磷酸環(huán)化為miltiradiene（圖1）。miltiradiene氧化為abietatriene是自發(fā)發(fā)生的，但暴露在紫外線照射下會加速。下游途徑中的一個關(guān)鍵中間體是鐵綠酚。對丹參、紫穗槐和藥用植物中CYP76家族的幾種細胞色素P450單加氧酶（CYP）進行了表征，它們能夠?qū)bietatriene轉(zhuǎn)化為鐵綠酚。這些酶統(tǒng)稱為鐵綠酚合成酶（FSs）。我們展示了先前從S. fruticosa和R. officinalis 中鑒定出的 FS進行兩次連續(xù)的氧化，產(chǎn)生了下一個中間體 11-羥基鐵杉醇，重新命名為 11-羥基鐵杉醇合酶 (HFS)。利用HFS和FS之間的相似性，來自丹參的FS中的三個氨基酸殘基與HFS中的相應(yīng)殘基反應(yīng)可以將FS轉(zhuǎn)化為HFS。
圖1 迷迭香和鼠尾草中PDs的生物合成。
HFSs的鑒定。使用為酵母開發(fā)的金門模塊化克隆載體系統(tǒng)，我們使用稱為FSs的CYPs，即CYP76AH1、CYP76AH4、CYP76AH22、CYP76AH23或CYP76AH24，然后在酵母中重建鐵綠酚生物合成。為了確保所有基因的有效共表達，我們開發(fā)了一個合成半乳糖誘導(dǎo)型啟動子文庫。正如預(yù)期的那樣，獲得的酵母菌株提取物在氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）測量（圖2a）中顯示了miltiradiene、abietatriene和鐵綠酚的存在。FS 和 HFS 的活性通過來自表達 CYP76AH1 和 CYP76AH22 酵母菌株的微粒體部分的體外實驗得到證實。
圖2 基于同源模型的FS和HFS突變。
為了分析 FS 和 HFS 之間的功能差異，我們對 CYP76AH1、CYP76AH4、CYP76AH22、CYP76AH23 和 CYP76AH24 進行同源建模。由于蛋白質(zhì)之間的高度序列同一性（平均 80%）導(dǎo)致預(yù)測的三級結(jié)構(gòu)幾乎相同。通過三維模型比較，表明在HFS活性位點（E301、S303和F478）中鑒定出三種氨基酸，它們在FS（D301、N303和V479）中不同，可能與鐵綠酚的氧化有關(guān)（圖2c、d）。
在酵母中測定了單突變以及幾種雙、三和四突變組合與 CM 的體內(nèi)共表達。HFS中第117和118 位的突變阻止了鐵銹醇的氧化，但 FS 中的相互突變不支持鐵銹醇的氧化，表明這些殘基不是鐵銹醇氧化所直接需要的。相比之下，雙突變體 FS D301E、N303S可以產(chǎn)生羥基鐵黃醇，但與 HFS 相比比例較小。此外，三重突變體 FS D301E、N303S、V479F具有與 HFS 無法區(qū)分的特征（圖2e,f），這也通過體外測定得到證實。這三種氨基酸在鐵銹醇氧化中的相關(guān)性通過對鐵銹醇停靠在活性位點上的三維模型的分析得到證實（圖2d）。總之，我們的結(jié)果表明，301、303和478處的氨基酸殘基對HFS中鐵綠酚的11-羥基化有重要貢獻，值得注意的是，F(xiàn)S中殘基的相互交換重新概括了HFS活性。
CYP76AK6-8 氧化C20產(chǎn)生 CA。CYP編碼基因經(jīng)常參與萜烯的氧化。為了確定CA途徑中缺失的步驟，我們搜索了與上游步驟表達模式相似的基因，即CPS和MiS，它們優(yōu)先在幼葉的毛狀體中表達。利用RNA（包括分離的毛狀體和無毛狀體的葉片，以及來自藥用植物和紫穗槐的幼葉和老葉）對從藥用植物和紫穗槐的RNA測序數(shù)據(jù)中確定的候選基因進行實時PCR分析。編碼高度相似蛋白質(zhì)的R.officinalis（RoCYP76AK7和RoCYP76AK8）和S.fruticosa（SfCYP76AK6）的CYP基因在幼葉中的轉(zhuǎn)錄水平高于老葉，并在毛狀體中特異表達（圖3a）。有趣的是，這些CYPs與FS和HFSs具有高度的序列相似性。
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圖 3：C 20 Ox的功能分析。（a）CYP76AK6-8在幼齡和老年毛狀體及無毛狀體葉片中的表達譜。( b )來自迷迭香葉表面或共表達 GGPPS、CPS、MS、ATR1、CYP76AH22 (HFS) 的酵母菌株的提取物的GC-MS 分析。（c）來自酵母或迷迭香的 PD 的電子沖擊質(zhì)譜。( d ) LC-MS 分析。( e ) 來自酵母的 PD 的 ESI 質(zhì)譜圖
由于CA途徑中氧化的確切順序尚不清楚，我們首先通過在煙草中瞬時與CPS和MiS共表達來檢測CYPs。通過GC-MS分析，在CPS、MiS、ATR1和CYP76AK7的葉片表面提取物中含有分子量為286和257的基峰，表明存在帶有醛基的二萜（圖3b、c）。GGPPS、CPS、MiS、ATR1和CYP76AK6、CYP76AK7或CYP76AK8在酵母中的共同表達產(chǎn)生了相同的化合物。純化和NMR分析后，該產(chǎn)物被鑒定為miltiradien-20-al。首次證明CYP76AK6、CYP76AK7和CYP76AK8可在C20位置氧化miltiradiene，因此被命名為C20Ox（圖4）。
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圖 4：工程 CA 途徑概述。
為了研究 C 20 Ox 除了 11-羥基鐵杉醇和miltiradiene之外，是否還可以氧化鐵杉醇。因此，將新鑒定的酶與 CPS、MS 和 FS (CYP76AH1) 共表達。GC-MS分析和與已發(fā)表數(shù)據(jù)的對比分析表明，少量的pisiferal的存在，表明鐵綠酚確實也是C20Ox的底物（圖3b、c）。
結(jié)論：
總之，在生物合成中，CA缺失基因的發(fā)現(xiàn)使酵母工程化成為可能。即使與復(fù)雜的化學(xué)合成相比，它也證明了酶促合成高價值產(chǎn)品的能力。用于酵母中 CA 生物合成的組合方法構(gòu)成了一個通用且有效的平臺，可以用來闡明和生產(chǎn)其他相關(guān)萜類化合物。
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鼠尾草酸staherb（迷迭香提取物）的生物合成及其在酵母中的重組 
