藥用植物內(nèi)生菌對烏蘇酸（熊果酸）的微生物轉(zhuǎn)化篩選 | 藥用植物內(nèi)生菌對烏蘇酸（熊果酸）的微生物轉(zhuǎn)化篩選 |
| 發(fā)布時間:2013-01-15 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):3836 |
藥用植物內(nèi)生菌對烏蘇酸（熊果酸）的微生物轉(zhuǎn)化篩選 付少彬， 楊峻山，崔晉龍， 孫迪安* ( 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所， 北京 100193) 摘要:目的 從藥用植物蛇足石杉分離純化內(nèi)生菌，并篩選可以轉(zhuǎn)化烏蘇酸的菌株， 以期探究利用藥用植物內(nèi)生菌對烏蘇酸 進行結(jié)構(gòu)修飾和改造的可行性 方法 通過組織塊法分離內(nèi)生菌; 用薄層色譜檢測轉(zhuǎn)化反應(yīng)的發(fā)生; 用 CTAB 法提取轉(zhuǎn)化菌 株的基因組 DNA， PCR 技術(shù)對其 ITS rDNA 進行擴增， 再經(jīng) Blast 比對鑒定菌株 結(jié)果 從藥用植物蛇足石杉的莖和葉中分離 得到內(nèi)生菌52 株， 用30 株對烏蘇酸進行轉(zhuǎn)化篩選 有4 株內(nèi)生菌具有轉(zhuǎn)化烏蘇酸的能力，經(jīng)表觀形態(tài)及分子生物學(xué)的方法 鑒定轉(zhuǎn)化菌株， 分別是 Pestalotiopsis microspora， Colletotrichum gloeosporioides， Fusarium chlamydosporum， Arthrinium. sp 結(jié)論 從 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)可以得出結(jié)論， 利用藥用植物內(nèi)生菌對天然活性成分烏蘇酸進行微生物轉(zhuǎn)化， 可以豐富烏蘇酸的結(jié)構(gòu)類型， 為獲得活性更好的衍生物提供技術(shù)和方法基礎(chǔ) 關(guān)鍵詞:藥用植物;蛇足石杉;內(nèi)生菌;微生物轉(zhuǎn)化;烏蘇酸;篩選 中圖分類號: R284 文獻標(biāo)志碼: A 文章編號: 1001 － 2494( 2011) 16 － 1225 － 04 Screening of Endophytic Fungi from Medicinal Plant for Microbial Transformation of Ursolic Acid FU Shao- bin， YANG Jun- shan， CUI Jin- long， SUN Di- an* ( Institute of Medical Plant Development， Chinese Academy of Medi- cal Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100193， China) ABSTRACT: OBJECTIVE To isolate and purify endophytes from medicinal plant Huperzia serrata and to screen the strains which can modify the structure of ursolic acid. METHODS Endophytes were isolated and purified by tissue segments， and the microbial transformation reactions of ursolic acid were identified by thin- layer chromatography ( TLC) ; the genomic DNA of transformation strains were extracted with CTAB method and amplified by PCR， and then compared by blast. RESULTS 52 Endophytes were obtained from the stems and leaves of medicinal plant H. serrata; 30 endophytes were screened， among which 4 could microbially transform ursolic acid. The transformation strains were indentified as Pestalotiopsis microspora， Colletotrichum gloeosporioides， Fusarium chlamydosporum， Arthrinium. Sp based on the morphological characteristics and ITS rDNA sequences. CONCLUSION Through the structures of the biotransformation products we can conclude that the microbial transformation of ursolic acid by enophytic fungi strains from H. serrata can diversify the structure of ursolic acid. The work in this paper paved the technical and methodological way for biotransformation of natural compound by endophytic fungi from medicinal plants to obtain derivatives with better activities. KEY WORDS: medicinal plant; Huperzia serrata; endophytes; microbial transformation; ursolic acid; screening 20 世紀(jì)末期內(nèi)生菌受到微生物學(xué)家植物學(xué)家 藥學(xué)家 微生態(tài)學(xué)家以及農(nóng)業(yè)科學(xué)家 植物保護工作人員的廣泛關(guān)注，成為植物微生物學(xué)學(xué)科發(fā)展的一次革命， 目前內(nèi)生菌的研究已成為多個學(xué)科交叉的新的生長點，也是當(dāng)前國內(nèi)外很多研究領(lǐng)域的熱點［1- 2］ 內(nèi)生真菌在藥用植物界分布廣泛，普遍存在各種藥用植物中， 而且?guī)缀趺糠N植物都有內(nèi)生菌據(jù)統(tǒng)計，近十多年來， 人們從47 科81 屬114 種3 變種藥用植物中分離到的內(nèi)生真菌就達到 171 屬， 涉及到了子囊菌擔(dān)子菌 接合菌 卵菌以及很多不產(chǎn)孢的類群［3］ 藥用植物內(nèi)生菌一方面可以產(chǎn)生多種活性成分，包括抗腫瘤活性成分紫杉醇類［4- 5］， 抗菌活性物質(zhì)［6- 7］， 另一方面還可以促進宿主植物產(chǎn)生更多的活性物質(zhì)［8- 9］， 此外還有抗生素物質(zhì)［10］， 抗糖尿病成分［11］等 所以利用藥用植物內(nèi)生菌篩選活性成分或新型化合物以創(chuàng)造新藥，可以很大程度緩解藥用植物資源短缺的問題烏蘇酸是一種 -香樹脂型五環(huán)三萜， 它在自然界分布很廣， 存在多種植物中， 如存在于杜鵑花科植物熊果的葉果實中， 玄參科植物毛泡桐的葉中， 以及木樨科植物女貞的葉中等 藥理學(xué)研究表明， 烏蘇酸具有多種生物活性， 如烏蘇酸及其衍生物具有抗腫瘤活性［12- 13］， 抗炎抗菌活性［14］， 抗HIV 活性［15］， 保肝護肝作用［16］等， 具有很好的開發(fā)價值為進一步增強烏蘇酸的藥理活性， 提高其生物利用度，對烏蘇酸進行結(jié)構(gòu)修飾和改造引起大家普遍關(guān)注 但是利用藥用植物內(nèi)生菌通過微生物轉(zhuǎn)化的方法對其進行結(jié)構(gòu)修飾筆者還未見報道本實驗從藥用植物蛇足石杉中分離內(nèi)生菌， 篩選具有轉(zhuǎn)化烏蘇酸能力的菌株，為以后進一步研究提供基礎(chǔ)1 材料和方法 1 材料和方法 1. 1 內(nèi)生菌的分離與純化 取健康蛇足石杉( 材料于2008 年采自貴州和重慶， 經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所孫迪安究員鑒定) 的莖和葉子， 在自來水下沖洗 2 h， 然后在超凈工作臺中用無菌水洗滌 10 次后， 莖用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡3 ～ 4 min， 0. 1%升汞浸泡 15 min， 而葉子則用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡1 min， 0. 1%升汞浸泡消毒10 min， 以達到表面消毒殺菌的目的，莖和葉再用無菌水洗滌5 次后切成小塊置于 PDA 平板，室溫黑暗培養(yǎng) 最后1 次洗滌的無菌水作為對照置于同樣條件培養(yǎng) 待組織切塊周圍長出菌絲時， 挑取菌絲尖端轉(zhuǎn)入 PDA 平板進行純化， 最后接入 PDA斜面上置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?/P> 1. 2 培養(yǎng)基 馬鈴薯去皮 200 g 切塊加蒸餾水煮沸 20 min，紗布過濾得濾液， 蒸餾水定容至 1 L， 加 20 g 葡萄糖， 固體培養(yǎng)基加入瓊脂20 g， 液體則不加， 121 ℃，高溫滅菌25 min， 制成 PDA 平板 斜面以及液體培養(yǎng)基備用1. 3 底物烏蘇酸底物( 長沙上禾生物科技發(fā)展有限公司) ， 通過與文獻［17］對比其1H- NMR， 13C- NMR， 確定為烏蘇酸 1. 4 烏蘇酸的微生物轉(zhuǎn)化篩選 取已經(jīng)純化的菌株于超凈工作臺上接種至已滅菌的100 mL 三角瓶的 PDB 液體培養(yǎng)基中( 內(nèi)裝 40mL 培養(yǎng)基) ， 28 ℃ 160 r min － 1恒溫振蕩培養(yǎng)， 2 ～3 d 后， 加入 0. 5 mg 烏蘇酸( 用乙醇溶解) ， 相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)10 d 同時2 個對照組在相同條件培養(yǎng)， 1 個底物對照組: 培養(yǎng)基中不接種微生物但等量的底物， 另1 個菌株對照組: 培養(yǎng)基中接種 物加入等體積的乙醇溶液( 無底物) 待發(fā)酵完后用等體積的乙酸乙酯超聲萃取 40 min， 減壓至小體積， 薄層色譜( TLC) 檢測轉(zhuǎn)化反應(yīng)是否發(fā)TLC 展開劑的條件: 石油醚-丙酮-乙酸( 3∶ 2∶ 0. 1及氯仿-甲醇( 12∶ 1) 放大發(fā)酵培養(yǎng)用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)的分離， 采用柱色譜及高效液相的方法， 而轉(zhuǎn)化的鑒定借助波譜學(xué)的手段完成 1. 5 轉(zhuǎn)化菌種的鑒定 對具有轉(zhuǎn)化烏蘇酸能力的菌株用 CTAB 法提取核糖體( rDNA) ， 選用通用引物 ITS1 ( 5- TCC GTAGGT GAA CCT GCG G- 3) 和 ITS4 ( 5- TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC- 3) 對ITS 區(qū)進行PCR 擴增，程序如下: 94 ℃預(yù)變性3 min; 94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s 以及72 ℃ 延伸1 min， 共進行30 個循環(huán); 72 ℃后延伸 10 min， 再經(jīng)過 NCBI 網(wǎng)站的Blast， 結(jié)合菌落形態(tài)及顯微觀察， 鑒定內(nèi)生菌的種類 2 結(jié)果與結(jié)論 從藥用植物蛇足石杉的莖和葉中分離得到內(nèi)生真菌52 株， 任選其中 30 株用于烏蘇酸的微生物轉(zhuǎn)化篩選， 經(jīng) TLC 檢測，共有 4 株可以轉(zhuǎn)化烏蘇酸其中 3 株從莖中分離得到， 1 株從葉子分離得到經(jīng)過對轉(zhuǎn)化菌種的表觀形態(tài)及 ITS rDNA 的 PCR 擴增及 Blast 比對， 這4 株真菌屬于不同的屬，分別鑒定為 Pestalotiopsis microspora ( 相似度100%) ， Colle-totrichum gloeosporioides ( 相似度 100%) ， Fusariumchlamydosporum ( 相似度 99%) ， Arthrinium. sp ( 相似度99%) 2. 1 菌株鑒定 P. microspora 從蛇足石杉的莖中分離得到， 新鮮標(biāo)本采自重慶 菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)見圖1 在 PDA 培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)， 菌絲生長較快， 6 d后菌落直徑達7. 1 ～ 7. 6 cm 菌落平坦， 邊緣整齊菌絲無色或接近無色該菌株的 ITS rDNA 序列長為511 bp， Blast 比對結(jié)果為， 與序列 P. microspora( GU441597. 1) 的相似性為 100% 結(jié)合菌落特征及孢子形態(tài)， 把該菌株定為 P. microsporaC. gloeosporioides 從蛇足石杉的莖中分離得到，新鮮標(biāo)本采自貴陽 菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)見圖2菌絲生長較快， 在 PDA 培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)6 d，菌落直徑可達 5. 9 ～ 6. 2 cm 左右 菌落灰白色， 氣生菌絲非常發(fā)達， 呈直立毛狀， 背面黑色或略帶褐 色 氣生菌絲無色至淡褐色，有隔 該菌株 ITS rD-NA 序列為 495 bp， 經(jīng) Blast 對比結(jié)果與序列 C.gloeosporioides ( HM034808. 1) 相似性為 100% 通過表型與基因型的綜合分析， 該菌株定為 C. gloeos-porioidesF. chlamydosporum 從蛇足石杉的莖中分離得到，新鮮標(biāo)本采自貴陽 菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)見圖3菌絲生長快， 在 PDA 培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)6 d， 菌 落直徑可達 7. 2 ～ 7. 8 cm菌落開始為白色， 后變成黃褐色， 背面可見黃褐
色 氣生菌絲通常發(fā)達，致密的叢毛狀 分生孢子梗初產(chǎn)生于氣生菌絲時不分枝或分枝的單一瓶梗狀或多瓶梗狀分生孢子無色光滑， 小型分生孢子多為單細胞， 卵圓形， 大小( 9 ～ 11) × ( 2 ～ 3) m; 大型分生孢子鐮刀形， 稍彎曲，( 31 ～ 34) × ( 2. 5 ～ 3. 5)m 該菌株的 ITS rDNA 序列為491 bp， 經(jīng) Blast 比對， 結(jié)果與序列 F. chlamydosporum ( HQ671187. 1)相似性為99%， 結(jié)合形態(tài)學(xué)特征， 我們把該菌株鑒定為 F. chlamydosporum Arthrinium. sp 從蛇足石杉的葉中分離得到， 新鮮標(biāo)本采自貴陽 菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)見圖4在 PDA 培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)，生長較緩慢， 6 d 后菌落直徑達 2. 1 ～ 2. 5 cm 菌落不平坦， 菌絲體初為白色， 后漸變?yōu)榉凵螯S色， 呈氈狀， 邊緣整齊氣生菌絲發(fā)達， 接近無色， 約1. 8 ～ 3. 5 m 該菌株的 ITS rDNA 序列長為554 bp， 經(jīng) Blast 比對， 結(jié)果與 序列 Arthrinium. sp( HQ630985. 1) 相似性為 99%但是通過形態(tài)學(xué)和 ITS 的分析， 該菌株我們只能鑒定到屬， 有待進一步研究 2. 2 轉(zhuǎn)化反應(yīng)的檢測 經(jīng) TLC 方法( 展開劑，石油醚-丙酮-冰醋酸 = 3∶2∶ 0. 01) 檢測內(nèi)生菌是否具有轉(zhuǎn)化烏蘇酸的能力其結(jié)果見圖 5 轉(zhuǎn)化粗提物中比菌對照中多出的點， 這些點我們初步判斷其是轉(zhuǎn)化產(chǎn)物 底物經(jīng)硫酸乙醇顯色后為紫紅色，而轉(zhuǎn)化產(chǎn)物也多為紅色 粉紅色 橘黃色等， 也輔助我們辨別轉(zhuǎn)化反應(yīng)的發(fā)生 2. 3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的多樣性 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)柱色譜和高效液相分離得到， 經(jīng)1D和2D NMR 及質(zhì)譜數(shù)據(jù)推導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)( 待發(fā)表) ， 有 3- oxo- 15 ， 30- dihydroxy - urs- 12- en- 28- oicac-id， 3 ， 15 - dihydroxy- urs- 12- en- 28- oic acid， 3 ， 15 ，30- trihydroxy- urs- 12- en- 28- oic acid， 3， 4- seco- ursan- 4， 30- dihydroxy- 12- en- 3， 28- dioic acid， 從這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)圖4 Arthrinium. sp 菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu) A －菌落; B －菌絲 Fig. 4 Colony morphology and microstructure of Arthrinium. sp A － colony; B － mycelia
圖5 內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化反應(yīng)的 TLC s －底物對照; 1 －轉(zhuǎn)化粗提物; 2 －菌對照Fig. 5 TLC of biotransformation reaction s － control for substrate; 1 － crude of biotransformation product; 2 － control for strain 物的結(jié)構(gòu)我們可以清晰地看出， 3 位的羥基基團可以氧化成羰基， 15 位可以引入 型的羥基，這在傳統(tǒng)的化學(xué)轉(zhuǎn)化中是很難實現(xiàn)的 除了環(huán)上發(fā)生羥基化反應(yīng)外， 30 位的側(cè)鏈也可以發(fā)生羥基化反應(yīng) 有些產(chǎn)物還發(fā)生開環(huán)反應(yīng)， A 環(huán)中 3 4 位的 C- C 單鍵打開， 4 位形成羥基， 而3 位氧化成羧基基團 在微生物轉(zhuǎn)化中， 往往伴隨著幾種反應(yīng)的同時發(fā)生內(nèi) 生菌與宿主植物長期共生， 由于其特殊的生境可能導(dǎo)致某些特殊的酶系產(chǎn)生， 進而催化特殊的反應(yīng) 3 討論 內(nèi)生菌在藥用植物體內(nèi)廣泛存在， 由于其所處的生態(tài)環(huán)境多樣性， 導(dǎo)致內(nèi)生菌的種類多樣性，其體內(nèi)所含的酶系也往往比較特殊 利用生物轉(zhuǎn)化的方法對已知天然活性成分進行結(jié)構(gòu)修飾改造， 得到新的衍生物， 結(jié)合藥理毒理實驗對天然活性產(chǎn)物進行構(gòu)效分析， 為尋找和開發(fā)新的高效低毒的化合物，提供了一條嶄新的途徑， 已成為新藥開發(fā)與研究的重要手段［18］ 本實驗研究了藥用植物內(nèi)生菌的新的活性領(lǐng)域， 已經(jīng)不僅僅局限于內(nèi)生菌所產(chǎn)生的活性物質(zhì)的研究 利用內(nèi)生菌對天然產(chǎn)物烏蘇酸進行生物轉(zhuǎn)化也為其結(jié)構(gòu)修飾提供了一定的研究基礎(chǔ)，為進一步開發(fā)其產(chǎn)物類型和藥理活性奠定了方法和技術(shù) 基礎(chǔ) REFERENCES ［1］ KONG Q K， DING A Y． Advances of study on endophytic bacte-ria as biologival control agents［J］． Journal of Shandong Agricul-tural University( Natural Science Edition) ( 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，理學(xué)版) ， 2001， 32 ( 2) : 256- 260. ［2］ HE R Q． Plant endophyte becomes one of hot topics in the current microbiological study in China［J］． Bull Microbiol( 微生物學(xué)通報) ， 2009， 36( 1) : 1- 1． ［3］ QIAO Q M， CHENG M G， WANG C L． Endophytes of medicinalplants in the development of natural medicine ［J］． Journal ofZhengzhou College of Animal Husbandry Engineering ( 鄭州牧業(yè)工程高等�？茖W(xué)校學(xué)報) ， 2008， 28( 1) : 24- 27． ［4］ CHEN Y J， ZHANG Z， WANG Y，et al． Screening endophyticfungus to produce taxol from Taxus yunnanensis［J］． Biotechnol-ogy ( 生物技術(shù)) ， 2003， 2( 3) : 10- 11. ［5］ SHRESTHA K， STROBEL G A， SHRIVASTSVA S P，et al． Evi-dence for paclitaxel from three new endophytci fungi of Himalayanyew of Nepal［J］． Planta Med， 2001， 67( 4) : 374- 376． ［6］ SUN L J， LU Z X， BIE X M， et al． Isolation and identification ofan antimicrobial endophytic strain EJH- 2［J］． Chin J Microecol( 中國微生態(tài)學(xué)雜志) ， 2006， 18( 1) : 23- 26． ［7］ DAI C C， YU B Y， XU Z L， et al． The screening and identifica-tion of endophytic fungi from four species of family euphorbiaceaeand the strains antibacterial activity［J］． Journal of Nanjing For-estry Universty ( Natural Sciences Edition) ［南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報( 自然科學(xué)版) ］， 2006， 30( 1) : 79- 83． ［8］ JIANG D F， MA P， ZHANG L Q， et al． The studies of fungal pop-ulation and relationship between fungi and forming of dragon sblood resin in Dracaena cochinchnensis［J］． Acta Bot Yunnanica( 云南植物研究) ， 1995， 17( 1) : 79- 82． ［9］ JIANG D F， MA P， ZHANG Y J， et al． Formation of blood resinin abiotic Dracaena cochinchinensis inoculated with Fusarium9568D［J］． Chin J Appl Ecol ( 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報) ， 2003， 14( 3) :477- 478． ［10］ LIU C H， ZOU W X， LU H，et al． Antifungal activity of Artemisiaannua endophyte cultures against phytopathogenic fungi［J］． JBiotechnol， 2001， 88( 3) : 277- 282． ［ 11］ ZHANG B， SALITURO G， SZALKOWSKI D， et al． Discovery ofsmall molecule insulin with antidiabetic activity in mice［J］． Sci-ence， 1999， 284( 5416) : 974- 977． ［ 12］ HSU Y L， KUO P L， LIN C C， et al． Proliferative inhibition， cell-cycle dysregulation， and induction of apoptosis by ursolic acid inhuman nonsmall cell lung cancerA549 cell［J］． Life Sci， 2004，19 ( 75) : 2303- 2316． ［ 13］ HARMAND P O， DUVAL R， DELAGE C， et al． Ursolic acid in-duces apoptosis through mitochondrial intrinsic pathway andcaspase- 3 activation inM4Beu melanoma cells［J］． Int J Cancer，2005， 114( 1) : 1 -11．［ 14］ CHATTOPADHYAY D， ARUNACHALAM G， MANDAL A B， etal． Antimicrobial and anti- inflammatory activity of folklore: Mall- otus peltatus leaf extract ［J］． J Ethnopharmacol， 2002， 82 ( 2-3) : 229- 237． ［ 15］ MA C M， NAKAMURA N， MIYASHIRO H，et al． Inhibitory effectsof constituents from Cynomorium songaricum and related triterpenederivativeson HIV- 1 protease［J］ ． Chem Pharm Bull， 1999， 47( 2) :141 -145． ［16］ SARASWAT B， VISEN P K， AGARWAL D P． Ursolic acid isola-ted from eucalyptus tereticornis protects against ethanol toxicity inisolated rat hepatocytes［J］． Phytother Res， 2000， 14 ( 3) : 161-166． ［ 17］ JU J H， ZHOU L， LIN G， et al． Studies on constituents of triter-pene acids from Eriobot rya j aponica and their anti- inflammatoryand antitussive effects［J］． Chin Pharm J ( 中國藥學(xué)雜志) ，2003， 38( 10) : 752- 757． ［ 18］ YU B Y． Biotransformation of natural bioactive compounds andthe development of creative drugs［J］． World Sci- tech R ＆ D ( 世界科技研究與發(fā)展) ， 1999， 21 ( 5) : 36- 39． |
