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厚樸中厚樸酚與和厚樸酚提取工藝研究

實驗原理

厚樸酚與和厚樸酚屬于酚類物質(zhì)，由于酚羥基的存在，其易溶于水、醇等極性溶劑。本實驗中采用乙醇作為提取試劑，采用連續(xù)回流提取的方法，按照正交實驗設(shè)計表L₉（3⁴）進行實驗，提取厚樸中的厚樸酚與和厚樸酚，并通過極差分析，得到較優(yōu)的實驗條件和各因素對實驗的影響主次順序。

2.2 實驗儀器、材料與試劑

2.2.1 實驗材料

厚樸粗粉。經(jīng)過80目篩，40目篩，20目篩篩選。

2.2.2 主要試劑

95%乙醇（分析純），蒸餾水。75%乙醇，70%乙醇，65%乙醇。

乙醇溶液濃度配置  使用500ml容量瓶配置溶媒所需要的濃度。先加入95%乙醇xml，再加入蒸餾水至刻度線，混合均勻。如表

表2.1 乙醇濃度的配置

2.2.3 儀器設(shè)備

1．玻璃儀器

2．電子儀器

3．其他

稱量紙，軟木塞，布氏漏斗，鐵架臺，夾子，鑰匙。

2.3 實驗內(nèi)容

2.3.1 實驗步驟

1．用電子天平精確稱取厚樸粗粉20g

2．用量筒量取x%乙醇，乙醇量為藥材量的y倍，

3．將厚樸粉末，乙醇液加入圓底燒瓶中，將圓底燒瓶放入水浴鍋，接上冷凝管。

4．加熱，圓底燒瓶中的溶液微沸時開始計時。加熱回流m次，每次n h，合并提取液。

5.．提取厚樸酚， 計算厚樸浸膏收率。

4因素3水平如表2.2所示。L₉（3⁴）正交設(shè)計表如表2.3所示。

表2.2 因素水平表

表2.3 厚樸正交實驗設(shè)計

2.3.2 鑒定

薄層層析過程如下，結(jié)晶品的甲醉液在硅膠G板上點樣，分別用苯-甲醇（27：1）和石泊醚-乙酸乙酯（9：l）展開，碘液顯色。厚樸酚，和厚樸酚均各顯一班點。

鑒定過程如下，①用5%FeCl的甲醇液滴定，可使溶液變成藍黑色；②用間苯三酚鹽酸液滴定，可使溶液變成粉紅色；③將試液、厚樸酚標準品、和厚樸酚標準品分別點于硅膠G薄層上，以苯-乙酸乙醋（8：2）展開，紫外燈下可見樣品液中厚樸酚的蘭紫色熒光舉點及和厚樸酚的紫紅色熒光斑點。其R_f值及斑點顏色均與標準品一致，可確定從厚樸中所提得的淡棕色結(jié)晶物的主要成分是厚樸酚及和厚樸酚。

2.4 結(jié)果與討論

2.4.1 實驗結(jié)果

正交實驗結(jié)果如表2.4所示。

表2.4 正交實驗結(jié)果

2.4.2 結(jié)果分析

1. 極差分析，確定因素的主次順序  首先解釋表2.4中引入的三個符號K_i，k_i，R。K_i表示任一列上水平號為i（本實驗中i=1，2或3）時，所對應(yīng)的實驗結(jié)果之和。例如，在表2.4中，在B因素所在的第2列上，第1，4，7號試驗中B取B₁水平，所以K₁為第1，4，7號試驗結(jié)果之和，即K₁=10.95+16.85+16.75=44.55；第2，5，8號試驗中B取B₂水平，所以K₂為第2，5，8號試驗結(jié)果之和，即K₂=17.1+11.75+17.8=46.65；第3，6，9號試驗中B取B₃水平，所以K₃為第3，6，9號試驗結(jié)果之和，即K₃=17.15+17.9+11=46.05；同理可以計算出其他列中的K_i，結(jié)果如表2.4所示。

k_i=K_i／s，其中s為任一列上各水平出現(xiàn)的次數(shù)，所以k_i表示任一列上因素取水平i時所得試驗結(jié)果的算術(shù)平均值。例如，在本實驗中s=3，在A因素所在的第1列中，k₁=45.2／3=15.067。同理可以計算出其他列中的k_i，結(jié)果如表2.4中所示。

R稱為極差，在任一列上R=max{K₁，K₂，K₃}-min{K₁，K₂，K₃}，或R=max{k₁，k₂，k₃}-min{k₁，k₂，k₃}。例如，在第一列上，最大的k_i­為k₂（15.500），最小的k_i為k₁（15.067），所以R=15.500-15.067=0.433，或R=46.5-45.2=1.3。

一般來說，各列的極差是不相等的，這說明各因素的水平改變對試驗結(jié)果的影響是不相同的，極差越大，表示該列因素的數(shù)值在試驗范圍內(nèi)的變化，會導致試驗指標在數(shù)值上更大的改變，所以極差最大的那一列，就是因素的水平對試驗結(jié)果影響最大的因素，也就是最主要的因素。在本實驗中，由于R_B>R_D>R_C>R_A,所以各因素的從主到次的順序為B（乙醇濃度），D（提取次數(shù)），C（乙醇用量），A（提取時間）。

2．優(yōu)方案的確定  優(yōu)方案是指在所做的試驗范圍內(nèi)，各因素較優(yōu)的水平組合。各因素優(yōu)水平的確定與試驗指標有關(guān)，若指標越大越好，則應(yīng)選取指標較大的水平，即各列K_i中最大的那個值對應(yīng)的水平；反之，若指標越小越好，則應(yīng)選取使指標小的那個水平。

在本實驗中，實驗指標是浸膏得率，指標越大越好，所以應(yīng)挑選每個因素的K₁，K₂，K₃中最大的值對應(yīng)的那個水平，由于A因素列中K₂>K₃>K₁；B因素列中K₂>K₃>K₁；C因素列中K₁>K₃>K₂；D因素列中K₃>K₂>K₁。

所以，優(yōu)方案為A₂B₂C₁D₃，即提取時間120min，乙醇濃度70%，乙醇用量6倍，提取次數(shù)3次。

另外，實際確定優(yōu)方案時，還應(yīng)區(qū)分因素的主次，對于主要因素，一定要按有利于指標的要切選取最好的水平，而對于不重要的因素，由于其水平改變對試驗結(jié)果的影響較小，則可以根據(jù)有利于降低消耗、提高效率等目的來考慮別的水平。例如，本實驗的A因素（提取時間）的重要性排在末尾，則可以考慮采用水平1的提取時間，即60分鐘，縮短了提取時間降低了能耗，即方案組合為A₁B₂C₁D₃，可以做實驗驗證其浸膏得率，確定是否為較優(yōu)方案。

3．進行驗證試驗，作進一步的分析  上述優(yōu)方案是通過理論分析得到，但它實際上是不是真正的優(yōu)方案還需要作進一步的驗證。將優(yōu)方案A₂B₂C₁D₃和較優(yōu)方案A₁B₂C₁D₃與正交表中最好的第6號試驗A₂B₃C₁D₂作對比試驗，如表2.5所示，若比第6號試驗的試驗結(jié)果更好，通常就可以認為是真正的優(yōu)方案，否則第6號試驗就是所需的優(yōu)方案。若出現(xiàn)后一種情況，一般來說可能是沒有考慮交互作用或者試驗誤差較大所引起的，需要作進一步的研究，可能還有提取試驗指標的能力。

表2.5 驗證試驗設(shè)計表

通過實驗結(jié)果可以得到，如預期分析的一樣， A₂B₂C₁D₃為最優(yōu)方案，A₁B₂C₁D₃為較優(yōu)方案。都比試驗號6的浸膏得率高，從縮短了提取時間降低了能耗角度考慮，可以采取A₁B₂C₁D₃的較優(yōu)方案，即提取時間60min，乙醇濃度70%，乙醇用量6倍，提取次數(shù)3次。

4．趨勢圖

浸膏得率對提取時間做趨勢圖，如圖2.1所示。

圖2.1 效應(yīng)曲線圖，因素為提取時間

由趨勢圖可以看出，隨提取時間水平的變動，浸膏得率在提高，120min時最高，之后得率降低。

浸膏得率對乙醇濃度做趨勢圖，如圖2.2所示。

圖2.2 效應(yīng)曲線圖，因素為乙醇濃度

由趨勢圖可以看出，隨乙醇濃度水平的變動，浸膏得率在提高，70%時最高，之后得率降低。

浸膏得率對乙醇用量做趨勢圖，如圖2.3所示。

圖2.3 效應(yīng)曲線圖，因素為乙醇用量

由趨勢圖可以看出，隨乙醇用量水平的變動，浸膏得率在降低，120ml時，浸膏得率最高。

浸膏得率對提取次數(shù)做趨勢圖，如圖2.4所示。

圖2.4 效應(yīng)曲線圖，因素為提取次數(shù)

由趨勢圖可以看出，隨提取次數(shù)水平的變動，浸膏得率在提高，2次時最高，之后緩慢提升。

2.4.3 討論

1．原料的目數(shù)的篩選  在提取過程中發(fā)現(xiàn)，用80目篩篩過的厚樸，由于顆粒較細，在回流提取過程中藥材很粘稠，容易產(chǎn)生暴沸現(xiàn)象，尤其是在2次以上回流次數(shù)時尤其明顯，即使加入沸石也不容易解決。抽濾時，過濾的溶液不是很澄清，懷疑是由于顆粒細，而濾紙孔徑有限，但這種輕盈也可能與厚樸酚的水溶性有關(guān)，厚樸酚在沸騰的乙醇中溶解度大，隨著抽濾的進行，溫度降低，在抽濾瓶中可能出現(xiàn)重結(jié)晶的想象�？紤]降低過篩目數(shù)是否可以解決這一問題，于是設(shè)計實驗，用同一厚樸原料分別過20目、40目、80目的篩，選正交設(shè)計表中1號試驗的實驗方案進行對比試驗，如表2.6所示。

表2.6原料的目數(shù)的篩選對比試驗

       注 實驗號1中即20目的提取實驗采用200ml的乙醇用量，因為120ml的乙醇不能將藥品充分浸泡，會產(chǎn)生糊化。

實驗結(jié)果顯示，使用20目、40目的厚樸在抽濾過程中比80目的容易，但抽濾液仍舊不澄清，說明是由于厚樸酚溶解度的改變在抽濾液中析出的晶體，并不是濾渣中通過濾紙的固體。

2．原料厚樸部位的篩選  原料厚樸選取的部位對試驗也會產(chǎn)生一定的影響。植物的許多部位都含有葉綠素，葉綠素在醇提過程中，會被大量的提取出來，使抽濾液變?yōu)榫G色干擾試驗，并且會使實驗結(jié)果不準確。因此試驗選取了不含葉綠素的部位，根部。

3．對提取時間水平的選擇  提取時間是影響最小的因素，隨提取時間的延長，浸膏得率升高，但在120min提取時間后，再延長提取時間，浸膏得率反而降低，說明提取時間不是越長越好，由于提取時間影響比較小，可以考慮縮短提取時間，這樣可以降低能耗，提高經(jīng)濟效益。

2.4.4 提取過程中出現(xiàn)的問題

1．在提取過程中由于厚樸比較粘稠，沸點又較高，在回流過程中需添加沸石，防止暴沸現(xiàn)象發(fā)生。尤其在需要回流多次的時候，在第二次回流時，由于是使用前一次的濾渣進行回流，因此藥材很粘稠，需要加沸石。

2．由于藥材粘度大，在抽濾時，濾紙可能會破，經(jīng)過與同學的探討，發(fā)現(xiàn)解決辦法可以在抽濾時增加濾紙層數(shù)。

在抽濾結(jié)束后，要先拔抽濾管，再關(guān)閉機器，否則會發(fā)生倒吸。

3．在需要多次回流的實驗組中，抽濾時可以暫不關(guān)閉水浴鍋，而將其溫度變化速度調(diào)節(jié)至最小而不關(guān)閉，可以節(jié)省下一次回流時水浴鍋中水加熱的時間。

4．抽濾過后的濾液由于時間不足，有需要過夜才旋蒸的，在旋蒸前要加熱下錐形瓶，使其中由于溫度降低析出的厚樸酚重新溶解，再轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中進行旋蒸，避免浸膏的損失。

5．在旋蒸時要控制真空度，溫度，避免由于沸騰使液體沖入回收瓶中，如果發(fā)生就需要重新旋蒸，在旋蒸快結(jié)束時，回收瓶中無液滴滴下要及時終止，如果再繼續(xù)旋蒸，此時浸膏中的液體已蒸發(fā)完，會使浸膏糊化，導致實驗失敗。

2.4.5 應(yīng)用前景

厚樸是我國特有的珍貴中藥材。長期以來，藥用厚樸主要利用野生資源，因此，一方面因資源過度消耗，日益枯竭被列為國家二級保護中藥材，另一方面因利用野生資源，與大多數(shù)中藥材一樣，存在有效成分含量低、不穩(wěn)定，難以滿足中藥現(xiàn)代化、國際化對植物藥品和產(chǎn)品提出的“安全、有效、可控、穩(wěn)定”的要求。因此，需要尋找和擴大新的藥用資源。目前，雖厚樸栽培面積大，資源分布豐富，由于生長速度慢，樸林更新時間長，加之社會需求量大，目前市場供應(yīng)日趨緊張，現(xiàn)狀一時難以滿足。擴大藥用部位研究，厚樸現(xiàn)應(yīng)用部位為枝、干、根皮及花蕾，種子供育苗用，而厚樸若以葉代替皮入藥，用量應(yīng)為皮5倍。而厚樸的木材目前尚未供藥用，有望在擴大藥源、改進栽培技術(shù)。厚樸是我國特有的珍貴中藥材，對其栽培技術(shù)研究很少，為了保護和發(fā)展厚樸資源，建議要把厚樸的科學研究作為中藥資源開發(fā)工作的一項重要措施來抓，近期內(nèi)加強厚樸生產(chǎn)技術(shù)研究，加強厚樸種源保護和收集，加強以利用為主的綜合開發(fā)研究以發(fā)揮厚樸的多種經(jīng)濟效益。

當前，通過各種技術(shù)手段尋找及研究傳統(tǒng)中藥中活性成分的工作已逐漸成為國內(nèi)外關(guān)注的重點。對厚樸的化學成分研究尚不十分深入。藥理活性上，主要集中在厚樸酚與和厚樸酚上，而對厚樸中其它成分藥理活性的研究不夠深入，因此，應(yīng)加強厚樸的化學成分研究，同時對除厚樸酚與和厚樸酚外的化合物進行全面的活性篩選，以使厚樸這一寶貴的中藥資源具有更好的利用價值。

醇提取厚樸中的厚樸酚與和厚樸酚，工藝簡單，價廉，可作為厚樸有效成分工業(yè)化提取的提取方法。具有高經(jīng)濟效益，小環(huán)境污染，設(shè)備易維護等優(yōu)點。具有廣闊的發(fā)展前景。

結(jié)  論

中藥厚樸為木蘭科木蘭屬喬木(Magnolia officinalis Rehd．et Wils)凹葉厚樸 (Magnolia officinalis Rehd．et Wils．var．biloba Rehd．et Wil)的干燥樹皮、根皮以及枝皮，具有行氣燥濕、降逆平喘之功效，用于治療脘腹脹痛、宿食不消、嘔吐瀉痢、氣逆喘咳等疾病，其主要活性成分為厚樸酚與和厚樸酚(honokiol)，它具有多種藥理作用，包括抗炎，抗心律失常，抗癲癇，抗血小板，抑制肌肉收縮和抗菌作用，此外還可以抑制氮的氧化產(chǎn)物，抑制腫瘤壞死因子α的表達活性等。

用于提取傳統(tǒng)中藥厚樸中厚樸酚與和厚樸酚，有多種方法，如堿提酸沉法，水提取法，乙醇提取法，聚酰胺分離提取法，堿提樹脂工藝，超臨界CO₂萃取等。其中乙醇提取法，根據(jù)文獻記載，提取結(jié)果中厚樸酚含量高，厚樸浸膏收率高，是傳統(tǒng)的工業(yè)提取方法。同時溶劑乙醇價廉，適合工業(yè)生產(chǎn)。

本論文采用乙醇回流提取的方法對厚樸進行了提取和分離，以正交試驗設(shè)計為工具，采用4因素3水平9次實驗來對各個因素進行研究，以浸膏得率作為質(zhì)量指標，考察醇法提取厚樸中厚樸酚與和厚樸酚的提取工藝條件，著重研究乙醇濃度、回流時間、提取次數(shù)、乙醇用量等因素對浸膏得率的影響，得到其較優(yōu)的提取工藝條件為提取時間120min，乙醇濃度70%，乙醇用量6倍，提取次數(shù)3次，經(jīng)驗證實驗表明浸膏得率可達到18.5%，并借助極差分析、方差分析等實驗數(shù)據(jù)分析手段，得到各因素的主次關(guān)系為B（乙醇濃度），D（提取次數(shù)），C（乙醇用量），A（提取時間）。

各因素影響趨勢為乙醇濃度對浸膏得率的影響最大，乙醇濃度提高時浸膏得率提高，在70%的時候浸膏得率最高，其次是提取次數(shù)，提取次數(shù)越大，浸膏得率越高。之后是乙醇用量，隨著乙醇用量的增加，浸膏得率降低，在8倍量后，又緩慢提升，說明乙醇用量6倍時最好。影響最小的因素是提取時間，隨提取時間的延長，浸膏得率升高，但在120min提取時間后，再延長提取時間，浸膏得率反而降低，說明提取時間不是越長越好，由于提取時間影響比較小，可以考慮縮短提取時間，這樣可以降低能耗，提高經(jīng)濟效益，所以需要綜合考慮其他因素。

厚樸作為中國傳統(tǒng)醫(yī)藥中的中藥藥材，臨床使用廣泛，具有很大的商業(yè)開發(fā)利用價值，相信隨著科學工作者的不斷努力，通過對實驗條件的不斷摸索，一定可以使浸膏得率，并通過優(yōu)化實驗過程，進一步分離純化，得到厚樸酚結(jié)晶，從而提高了有效成分的濃度，以及原材料的利用率，更高效的利用天然藥物改善人類的健康和生活質(zhì)量。

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