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杜仲皮水提取物舒張大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的作用及機(jī)制

摘要：

目的 探討杜仲葉提取物對(duì)人體內(nèi)腹部脂肪蓄積的抑制作用.方法 將27例腹型肥胖患者隨機(jī)分為2組(試驗(yàn)組15例,對(duì)照組12例),分別口服杜仲膠囊(含杜仲葉提取物)及安慰劑膠囊,第8周末觀察每組患者體重、腹圍、體重指數(shù)(BMI)、皮下脂肪及內(nèi)臟脂肪的變化.結(jié)果 試驗(yàn)組與對(duì)照組比較,內(nèi)臟脂肪及皮下脂肪明顯減少(P＜0.05),體重降低,腹圍顯著減少(P＜0.001),BMI亦顯著下降(P＜0.01).結(jié)論 杜仲葉提取物能明顯抑制腹部脂肪蓄積,減輕腹型肥胖狀態(tài),可作為治療腹型肥胖的基本用藥

Abstract：

Objective To investigate the depressant effect of Eucommia ulmoides leaves extract on human abdominal fat.Methods Twenty-seven patients with abdominal obesity were randomly divided into two groups( experimental group included 15 patients and control group included 12 patients),and were given oral Eucommia capsule( containing Eucommia ulmoides leaves extract) and oral placebo capsule respectively.Observed the change of weight,abdominal circumference,body mass index( BMI ),visceral fat and subcutaneous fat of patients in each group after 8 weeks.Results Compared with control group,the visceral and subcutaneous fat of the experimental group decreased significantly ( P ＜ 0.05 ),the weight and abdominal circumference of the experimental group decreased remarkably ( P ＜ 0.001 ),and BMI of the experimental group also decreased remarkably( P ＜0.01 ).Conclusions The Eucommia ulmoides leaves extract significantly inhibited the accumulation of abdominal fat and abdominal obesity,and could be used as the basic drugs to treat abdominal obesity.

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.；Du-zhong）是傳統(tǒng)中藥， 祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有補(bǔ)肝腎， 強(qiáng)筋骨，安胎之功效[1] 。杜仲的化學(xué)成分復(fù)雜，主要含木脂素類，環(huán)烯醚萜苷類，揮發(fā)油，多糖，氨基酸，有機(jī)酸，甾醇，磷脂，維生素，微量元素以及硬性膠等，其中以木脂素類和環(huán)烯醚萜苷類研究為多 [2] 。

杜仲的藥理作用非常廣泛，能抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫，對(duì)多種疾病有很高的價(jià)值，尤其在治療高血壓方面，杜仲被認(rèn)為是現(xiàn)在世界最高質(zhì)量的無副作用的天然降壓藥物。過去的研究認(rèn)為其降壓的主要成分是松脂醇二葡萄糖苷。[3] 雖然杜仲具有舒張血管降低血壓的作用，然而其對(duì)離體血管的作用機(jī)制尚未十分了解，因此本實(shí)驗(yàn)在大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)灌流模型的基礎(chǔ)上，通過觀察杜仲皮提取物對(duì)內(nèi)皮完整和去除內(nèi)皮的血管環(huán)張力的影響，探討其對(duì)血

管平滑肌的作用及可能的機(jī)制。

1  材料與方法

 1.1   設(shè)備  離體血管環(huán)灌流裝置，JZJ01 型肌力換能器，HSS－1B 型數(shù)字式超級(jí)恒溫浴

RM6240B 型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，均都儀器廠產(chǎn)品。

1.2   藥物與試劑   苯腎上腺素（PhenylephPE） ，乙酰膽堿（Acetylcholine，Ach） ，左旋硝氨酸甲脂（N（omega）-nitro-L-methyl-eL-NAME） ，吲哚美辛（Indomethacin，In1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-alpha]quinoxalin-1-on(ODQ)， 格列苯脲 （Glibenclamide） ， 以上均為公司產(chǎn)品，杜仲皮水提取物由浙江大學(xué)藥學(xué)取，用 K-H液配制含杜仲提取物 20mg/ml 的Krebs-Henseleit （K-H） 液 （mmol/L） ： NaCKCL 4.7、 KH2PO4   1.2、 MgSO4 •7H2O 1.2、 N25，glucose 10、CaCL2 1.25。

1.3   血管環(huán)的制備  Sprague-Dawley（SD）雄性，體重 200－280 g，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)

驗(yàn)中心提供。每個(gè)大鼠的胸主動(dòng)脈被分成 6 段隨機(jī)分入 6個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行平行研究。

具體方法為：用鈍器擊昏大鼠后充分放血，迅速取胸主動(dòng)脈， 置于通以95％O2和5％CO2混合氣體預(yù)飽和地4°C K-H液中， 去除周圍結(jié)締組織后將血管剪成約3~4mm的血管環(huán)，避免過度牽拉，以防損傷內(nèi)皮。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，去除血管內(nèi)皮時(shí)，用鑷子磨擦血管環(huán)內(nèi)表面以去除內(nèi)皮細(xì)胞。將血管環(huán)懸掛于預(yù)置10ml K-H液的浴槽內(nèi)，37°C恒溫，持續(xù)通以95

％O2和5％CO2的混合氣體。靜息張力0g穩(wěn)定血管30min，每隔15min換一次K-H液，此后調(diào)節(jié)靜息張力為2g，穩(wěn)定穩(wěn)定1h，期間每隔15min換一次K-H液。用3M的KCL重復(fù)刺激3次，以誘發(fā)血管的最大收縮幅度。待血管穩(wěn)定后，用10-4 mol/L PE預(yù)收縮血管環(huán)達(dá)峰值，加入10-3 mol/L Ach檢驗(yàn)內(nèi)皮的完整性。加入Ach后使PE預(yù)收縮的血管環(huán)舒張60％~90％，認(rèn)為內(nèi)皮完整，反之，認(rèn)為內(nèi)皮被破壞。 實(shí)驗(yàn)用 RM6240B 型生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄血管張力的變化， 分別以末次KCL （終濃度6×10-2 mol/L） 、PE（終濃度 10-8

mol/L）刺激引起的最大收縮幅度為標(biāo)準(zhǔn)，以加入藥物后的血管張力幅度與之相比所得百分比比值表示。

1.4   實(shí)驗(yàn)分組  

1.4.1   累積濃度杜仲水提取液對(duì) PE 預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)的作用（有內(nèi)皮組） ：實(shí)驗(yàn)組（n＝7） ，用 PE（10-4mol/L）預(yù)收縮血管，達(dá)穩(wěn)定后用累積加藥法，以每 15min 加杜仲水提取液一次，使灌流液中的杜仲提取物終濃度分別達(dá) 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2（mg/mL） ，觀察杜仲提取物對(duì)對(duì) PE 預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)的作用。

1.4.2   累積濃度杜仲水提取液對(duì) PE 預(yù)收縮去內(nèi)皮的血管環(huán)的作用（去內(nèi)皮組） ：實(shí)驗(yàn)組（n＝7） ，用PE（10-4mol/L）預(yù)收縮血管，達(dá)穩(wěn)定后用累積加藥法，以每 15min 加杜仲水提取液一次，使灌流液中的杜仲提取物終濃度分別達(dá) 0.2、 0.4、 0.8、 1.6、 2.4、

3.2（mg/mL） ，觀察杜仲提取物對(duì) PE 預(yù)收縮去除內(nèi)皮的血管環(huán)的作用。

1.4.3   累積濃度杜仲水提取液對(duì) KCL 預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)的作用（KCL 組） ：實(shí)驗(yàn)組（n＝6） ，用 KCL（60mmol/L）預(yù)收縮血管，達(dá)穩(wěn)定后用累積加藥法，以每 15min 加杜仲水提取液一次，使灌流液中的杜仲提取物終濃度分別達(dá) 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2（mg/mL） ，觀察杜仲提取物對(duì) KCL預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)的作用。

1.4.4   L-NAME 對(duì)杜仲誰提取物作用影響組（L-NAME 組） ：實(shí)驗(yàn)組（n＝8） ，內(nèi)皮完整的血管環(huán)用 10-4mol/L L-NAME預(yù)處理 15min 后，再用 PE（10-4mol/L） 預(yù)收縮血管， 達(dá)穩(wěn)定后用累積加藥法，以每 15min 加杜仲水提取液一次，使灌流液中的杜仲提取物終濃度分別達(dá) 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2（mg/mL） ，觀察 L-NAME 預(yù)處理后杜仲提取物對(duì) PE 預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)的作用。

1.4.5   Indo對(duì)杜仲誰提取物作用影響組（Indo組） ：實(shí)驗(yàn)組 （n＝6） ， 內(nèi)皮完整的血管環(huán)用 10-5mol/L Indo預(yù)處理 15min 后，再用 PE（10-4mol/L）預(yù)收縮血管，達(dá)穩(wěn)定后用累積加藥法，以每 15min 加杜仲水提取液一次，使灌流液中的杜仲提取物終濃度分別達(dá) 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2（mg/mL） ，觀察 Indo預(yù)處理后杜仲提取物對(duì) PE 預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)的作用。

1.4.6   格列苯脲（Glib）對(duì)杜仲誰提取物作用影響組（格列苯脲組） ：實(shí)驗(yàn)組（n＝6） ，內(nèi)皮完整的血管環(huán)用3µmol/L格列苯脲預(yù)處理15min后， 再用PE（10-4mol/L） 預(yù)收縮血管， 達(dá)穩(wěn)定后用累積加藥法，以每 15min 加杜仲水提取液一次，使灌流液中的杜仲提取物終濃度分別達(dá) 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2（mg/mL） ，觀察格列苯脲預(yù)處理后杜仲提取物對(duì) PE 預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)的作用。

1.4.7   ODQ 對(duì)杜仲誰提取物作用影響組（ODQ組） ：實(shí)驗(yàn)組（n＝7） ，內(nèi)皮完整的血管環(huán)用10µmol/LODQ預(yù)處理15min后， 再用PE （10-4mol/L）預(yù)收縮血管，達(dá)穩(wěn)定后用累積加藥法，以每 15min加杜仲水提取液一次，使灌流液中的杜仲提取物終

濃度分別達(dá) 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2（mg/mL） ，觀察ODQ預(yù)處理后杜仲提取物對(duì)PE預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)的作用。1.4.8   4-AP 對(duì)杜仲誰提取物作用影響組（4-AP

組） ：實(shí)驗(yàn)組（n＝6） ，內(nèi)皮完整的血管環(huán)用1mmol/L4-AP預(yù)處理15min后， 再用PE （10-4

mol/L）預(yù)收縮血管，達(dá)穩(wěn)定后用累積加藥法，以每 15min加杜仲水提取液一次，使灌流液中的杜仲提取物終濃度分別達(dá) 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2（mg/mL） ，觀察4-AP預(yù)處理后杜仲提取物對(duì)PE預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)的作用。

1.4.9   TEA對(duì)杜仲誰提取物作用影響組 （TEA組） ：實(shí)驗(yàn)組 （n＝5） ， 內(nèi)皮完整的血管環(huán)用 1mmol/L4-AP預(yù)處理 15min 后，再用 PE（10-4mol/L）預(yù)收縮血管，達(dá)穩(wěn)定后用累積加藥法，以每 15min 加杜仲水提取液一次，使灌流液中的杜仲提取物終濃度分別

達(dá) 0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2（mg/mL） ，觀察TEA 預(yù)處理后杜仲提取物對(duì) PE 預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)的作用。

1.4.10  杜仲水提取物舒血管作用的時(shí)間效應(yīng)組（效應(yīng)組） ：實(shí)驗(yàn)組（n＝4） ，內(nèi)皮完整的血管環(huán)用 PE（10-4mol/L）預(yù)收縮血管，達(dá)穩(wěn)定后一次性加藥，使灌流液中的杜仲提取物終濃度達(dá) 3.2（mg/mL） ，每隔 2min 記錄一次血管環(huán)的張力，觀察杜仲提取物對(duì)PE預(yù)收縮內(nèi)皮完整的血管環(huán)作用的時(shí)間效應(yīng)。 

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1.5   統(tǒng)計(jì)處理   試驗(yàn)結(jié)果用X ±s表示， 用MicrosoftExcel 軟件處理，兩組間比較采用 t 檢驗(yàn)，多組間比較采用 ANOVA 法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，p<0.05 認(rèn)為有顯著性差異。

2  結(jié)果

2.1   杜仲皮水提取物對(duì)PE預(yù)收縮的主動(dòng)脈環(huán)張力的影響 如圖 1 所示， 可使如圖 1所示,  杜仲皮水提取物可使 PE 預(yù)收縮的內(nèi)皮完整主動(dòng)脈環(huán)舒張， 與 PE 預(yù)收縮時(shí)的最大張力比較，血管張力明顯降低（##p<0.01） 。且呈劑量依賴性。杜仲皮水提取物對(duì)

PE 預(yù)收縮去內(nèi)皮動(dòng)脈環(huán)血管張力的影響顯著小于對(duì)內(nèi)皮完整血管的影響（* p<0.05） ，不能很好地舒張去內(nèi)皮的血管環(huán)。 杜仲皮水提取物（mg/mL）  

圖 1.  杜仲皮水提取物對(duì) PE 預(yù)收縮的主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

Fig.1  Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat. A: Records from experiments illustrating the effect of increasing dose of Eucommia on the tension of PE precontracted aorta rings with(right,+E)or without(underside,-E)endothelium. B:Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings with or whithout endothelium. ##p＜0.01compared with predrug  value （concentration 0） *p＜0.05 compare  PE（+E）  with  PE（－E）

2.2   杜仲皮水提取物對(duì)KCL預(yù)收縮的主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

為了觀察杜仲皮水提取物是否對(duì)KCL誘導(dǎo)的血管收縮作用有影響，用60mmol/L的KCL收縮血管。結(jié)果表明，杜仲對(duì)KCl預(yù)收縮主動(dòng)脈環(huán)張力有顯著的舒張作用（##p＜0.01） ，在杜仲濃度達(dá)到3.2mg/ml時(shí)PE組和KCl組有顯著差異（*p<0.05）外，其余濃度PE組和KCl組無顯著差異（p>0.05） 。 （如 圖2

圖 2杜仲皮水提取物對(duì) KCl預(yù)收縮主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

Fig.2   Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of KCl precontracted aorta rings of  rat. Pooled data of mean normalized vessel tension obtained from KCl precontracted and PE precontracted aorta rings with endothelium .p<0.05 compared with PE（＋E）group，##p<0.01 compared with predrug  value （concentration 0）.

2.3        杜仲皮水提取物對(duì)PE預(yù)收縮L-NAME的主動(dòng)脈環(huán)張力的影響 為了探討NO-GC途徑是否參與杜仲皮水提取物的血管舒張作用， 用NO抑制劑L-NAME處理內(nèi)皮完整的血管環(huán)后，觀察杜仲皮水提取物對(duì)血管張力的影響。L-NAME預(yù)處理后，L-NAME自身對(duì)PE誘導(dǎo)的血管張力無明顯影響,但杜仲皮水提取物對(duì)PE預(yù)收縮的血管產(chǎn)生的舒張作用被抑制（圖3） 。

圖3杜仲皮水提取物對(duì)L-NAME處理主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

Fig 3. Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by L-NAME.  A:  Records from experiments illustrating the effect of  Eucommia ulmoides Oliv on the phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by L-NAME.  B:Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings(pretreated by L-NAME) with endothelium.##p ＜ 0.01 compared with predrug  value （concentration 0） ，#p＜0.05 compare PE（＋E）group with L-NAME＋PE（＋E）group.

2.4  杜仲皮水提取物對(duì)PE預(yù)收縮Indo處理的主脈環(huán)張力的影響 為了探討環(huán)氧合酶（COX）途徑是否參與杜仲皮水提取物的血管舒張作用，采用內(nèi)皮完整的血管環(huán)用環(huán)氧合酶抑制劑 Indo 處理后， 觀察杜仲皮水提取物對(duì)血管張力的影響。Indo 預(yù)處理后，杜仲皮水提取物對(duì) PE 預(yù)收縮的血管產(chǎn)生的舒張作用被減弱（#p＜0.05） ，但 Indo 處理自身對(duì) PE 誘導(dǎo)的血管張力無明顯影響（圖 4） 。

圖 4杜仲皮水提取物對(duì) Indo 預(yù)處理主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

Fig. 4 Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension ophenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which havebeen pretreated by Indo.  A:  Records from experimentillustrating the effect of  Eucommia ulmoides Oliv on thephenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rawhich have been pretreated by I.  B:Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings(pretreated by indomethacin) with endothelium。#p＜0.05compare PE（＋E）group with Indo＋PE（＋E）group.

2.4        杜仲皮水提取物對(duì)PE預(yù)收縮ODQ處理的主動(dòng)脈環(huán)張力的影響 為了探討鳥苷酸環(huán)化酶途徑是否參與杜仲皮水提取物的血管舒張作用，用鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑ODQ處理內(nèi)皮完整的血管環(huán)后， 觀察杜仲皮水提取物對(duì)血管張力的影響。ODQ預(yù)處理后，杜仲皮水提取物對(duì) PE 預(yù)收縮的血管產(chǎn)生的舒張作用顯著減弱（##p＜0.01） ，但 ODQ 自身對(duì) PE 誘導(dǎo)的血管張力無明顯影響

圖 5  杜仲皮水提取物對(duì)ODQ預(yù)處理主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

Fig. 5  Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by ODQ. A: Records from experiments illustrating the effect of  Eucommia ulmoides Oliv on the phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by ODQ.B：Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings(pretreated by ODQ) with endothelium. ##p＜0.01 compare PE（＋E）group with ODQ＋PE（＋E）grou2.6

 杜仲皮水提取物對(duì)PE預(yù)收縮TEA處理的主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

為了研究杜仲皮水提取物的血管舒張作用是否通過 Ca2＋敏感性 K＋通道發(fā)揮作用，用 Ca2＋敏感性 K＋通道抑制劑 TEA處理內(nèi)皮完整的血管環(huán)后，觀察杜仲皮水提取物對(duì)血管張力的影響。TEA預(yù)處理后，杜仲皮水提取物對(duì) PE 預(yù)收縮的血管無明顯舒張作用（p>0.05） ，且 TEA處理自身對(duì) PE 誘導(dǎo)的血管張力無明顯影響。

圖 6杜仲皮水提取物對(duì)四乙胺（TEA）預(yù)處理主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

Fig. 6 Effect of Eucommia ulmoides Oliv on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by TEA. A: Records from experiments illustrating the effect of  Eucommia ulmoides Oliv on the phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by TEA.B: Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings(pretreated by TEA) with endothelium. p ﹥0.05compare PE（＋E）group with TEA＋PE（＋E）group。 

2.7  杜仲皮水提取物對(duì)PE預(yù)收縮Glib處理的主動(dòng)脈環(huán)張力的影響

為了研究杜仲皮水提取物的血管舒張作用是否通過 ATP敏感性 K＋通道發(fā)揮作用，用 ATP敏感的 K＋通道抑制劑格列本脲（Glib）處理完整的血管環(huán)后，觀察杜仲皮水提取物對(duì)血管張力的影響。處理后，杜仲皮水提取物對(duì) PE 預(yù)收縮血管的舒張作用未被明顯減弱（p>0.05） ，且格列本脲（Gli）處理自身對(duì) PE 誘導(dǎo)的血管張力無明顯影響。