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 積雪草中皂甙類(lèi)成分的常規(guī)分離方法是采用硅 膠柱反復(fù)分離，然后重結(jié)晶獲得¨ 。目前市場(chǎng)上銷(xiāo) 售的積雪草甙和羥基積雪草甙兩種對(duì)照品主要是通 過(guò)該方法獲得的，產(chǎn)品的純度在95％ 以下。有采用 高速逆流色譜法從積雪草中分離獲得毫克級(jí)的皂甙 類(lèi)成分的報(bào)道¨ 。本文采用制備型高效液相色 譜法(Pre—HPLC)，在20 min的分離時(shí)間內(nèi)完成分 離，制備了積雪草甙和羥基積雪草甙兩個(gè)成分。通 過(guò)薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)對(duì) 獲得的產(chǎn)品進(jìn)行分析，產(chǎn)品純度達(dá)到98％ 以上，可 以作為積雪草甙和羥基積雪草甙對(duì)照品使用。本方 法制備積雪草甙和羥基積雪草甙對(duì)照品具有高效快 速、產(chǎn)品純度高的特點(diǎn)，可以作為制備高純度的積雪 草甙和羥基積雪草甙對(duì)照品的方法。

 1 實(shí)驗(yàn)部分

 1．1 儀器與試劑

 Waters Delta 4000制備型高效液相色譜儀，配 996型二極管陣列檢測(cè)器；Waters 2695型高效液相 色譜儀，配996型二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters 公司)；N—N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Eyela公司)；X一4 數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京泰克儀器有限公 司)。甲醇(色譜純，中國(guó)禹王公司)；乙腈(色譜純， Fisher Chemicals公司)；實(shí)驗(yàn)用水由Milli Q純水 系統(tǒng)制備。積雪草粗甙提取物(廣西昌洲天然產(chǎn)物 開(kāi)發(fā)有限公司)；積雪草甙、羥基積雪草甙對(duì)照品 (中國(guó)生物制品檢驗(yàn)鑒定所，定性分析用)。

 1．2 色譜條件

 制備型HPLC條件：自填Microsorb C 柱(50 mm ×200 mm，5 m)；流動(dòng)相：甲醇一水(體積比為 60：40)，流速100 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣 量：1．5 mL。

 分析型HPLC條件：大連江申公司裝填的Mi— crosorb C18柱(4．6 mm ×250 mm，5 m)；流動(dòng)相： 甲醇一水(體積比為60：40)，流速1 mL／min；檢測(cè)波 長(zhǎng)：200 nm；進(jìn)樣量：10 L。

 1．3 樣品處理

 稱(chēng)取積雪草粗甙樣品6 g，甲醇溶解，配制成濃 度為40 mg／mL的溶液，過(guò)0．45 m 微孔濾膜，供 樣品分析和制備使用。

 1．4 樣品分析

 取按照“1．3”節(jié)方法處理后的樣品溶液適量， 用甲醇稀釋10倍后進(jìn)行分析，以積雪草甙、羥基積雪草甙對(duì)照品為對(duì)照，采用外標(biāo)法定量，積雪草粗甙 樣品中含有積雪草甙20％ ，羥基積雪草甙45％ 。

 1．5 樣品制備

 采用制備型HPLC系統(tǒng)進(jìn)行制備純化，多次進(jìn) 樣，收集積雪草甙和羥基積雪草甙所在部分洗脫液， 減壓濃縮后，置于烘箱內(nèi)干燥，得到0．8 g積雪草甙 和2 g羥基積雪草甙。圖1為積雪草粗甙的制備色 譜圖。

 2 結(jié)果與討論

 2．1 制備色譜條件的優(yōu)化

 制備色譜條件的優(yōu)化從樣品的溶解開(kāi)始。通過(guò) 分析型色譜來(lái)優(yōu)化分離條件，然后運(yùn)用線性放大技 術(shù)在制備色譜中放大。

 通過(guò)優(yōu)化色譜條件使目標(biāo)成分與干擾成分在分 析型色譜中的分離度 大于2，保證分析型色譜條 件放大后經(jīng)簡(jiǎn)單調(diào)整即可在制備型色譜中達(dá)到滿意 的效果。使用反相制備色譜制備對(duì)照品時(shí)，通常小 的保留因子k對(duì)制備分離更有利，因?yàn)樾〉谋Ａ粢?子k意味著小的出峰體積及洗脫液中化合物具有更 高的濃度¨ 。本實(shí)驗(yàn)中積雪草甙和羥基積雪草甙 的k分別約為3．2和5．2。

 制備型色譜流動(dòng)相的流速、進(jìn)樣量分別按照如 下放大公式計(jì)算：F =F ×(D ／D ) ，L =L × (D ／D ) (式中Fp為制備型色譜流動(dòng)相流速， 為分析型色譜流動(dòng)相流速，D 為制備柱的直徑，D 為分析柱的直徑， 為制備型色譜進(jìn)樣量， 為分 析型色譜進(jìn)樣量)�？紤]到在制備過(guò)程中的產(chǎn)品產(chǎn) 率、純度及溶劑消耗，適當(dāng)調(diào)整并最終確定了“1．2” 節(jié)所述的制備色譜條件。

 2．1．1 樣品溶解條件的選擇

 選擇合適溶劑溶解樣品對(duì)樣品的制備是重要的一環(huán)。所選擇的溶劑應(yīng)對(duì)樣品具有很高的溶解度， 不干擾樣品的分離，容易處理。本文比較了丙酮、甲 醇、乙腈、水、N，N_-甲基甲酰胺、四氫呋喃，其中 N，N-Z．甲基甲酰胺對(duì)樣品的溶解性最好，甲醇次 之。使用Ⅳ，Ⅳ．二甲基甲酰胺溶解樣品時(shí)，需使用特 殊的濾膜，且后處理復(fù)雜，故本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有使用該溶 劑。本實(shí)驗(yàn)使用甲醇作為溶劑溶解樣品，得到濃度 為40 mg／mL的樣品溶液。

 2．1．2 流動(dòng)相的選擇

 甲醇一水作為流動(dòng)相組分具有價(jià)格低廉的特點(diǎn)， 可以作為反相制備色譜流動(dòng)相組成的首選。通過(guò)優(yōu) 化甲醇一水的比例、流動(dòng)相流速使樣品達(dá)到需要的分 離效果。流動(dòng)相比例、流速會(huì)影響樣品的分離效果、 分離時(shí)間、目標(biāo)成分濃縮效果等多個(gè)方面。根據(jù)本 實(shí)驗(yàn)所用分析柱和制備柱的規(guī)格，制備色譜中流動(dòng) 相理論流速應(yīng)為118 mL／min，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中采用的流 動(dòng)相流速為100 mL／min。

 2．1．3 最佳進(jìn)樣量的選擇

 制備色譜以獲得大量的單成分為目的，所以確 定最佳進(jìn)樣量是制備色譜優(yōu)化的一個(gè)主要方面，希 望通過(guò)加大進(jìn)樣量，尋找保證分離效果的最大過(guò)載 進(jìn)樣量來(lái)提高工作效率。加大進(jìn)樣量由樣品溶液的 濃度和進(jìn)樣體積兩方面決定。在確定了樣品溶解條 件后，樣品溶液的濃度即已確定。在樣品濃度一定 的情況下，通過(guò)增大進(jìn)樣體積來(lái)增大進(jìn)樣量。隨著 進(jìn)樣量的增加，目標(biāo)成分與相鄰成分的分離度會(huì)逐 漸降低，影響目標(biāo)組分的分離，進(jìn)樣量達(dá)到一定量 后，相鄰成分無(wú)法分離 。

 在樣品質(zhì)量濃度為40 mg／mL條件下，考察了 不同進(jìn)樣體積(0．8～2 mL)對(duì)分離度的影響。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，0．8～1．5 mL進(jìn)樣體積范圍內(nèi)，目標(biāo)成分 與干擾成分分辨率逐漸降低，峰重疊加重；進(jìn)樣體積 大于1．5 mL后，目標(biāo)成分與干擾成分重疊嚴(yán)重，無(wú) 法選取適當(dāng)?shù)那懈钗恢茫�使目�?biāo)成分的純度無(wú)保證。 因此，本實(shí)驗(yàn)選擇進(jìn)樣體積為1．5 mL。

 2．1．4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

 與分析型色譜相比較，制備色譜所選擇的檢測(cè) 波長(zhǎng)并不一定是目標(biāo)成分的最大吸收波長(zhǎng)，選擇一 個(gè)可以監(jiān)測(cè)到目標(biāo)成分和干擾成分分離的波長(zhǎng)更加 合適¨ 。在逐漸加大樣品進(jìn)樣量的情況下，如優(yōu)先 選擇目標(biāo)成分的最大波長(zhǎng)，很容易發(fā)生色譜柱未超 載，而檢測(cè)信號(hào)已經(jīng)過(guò)載的情況，即色譜峰在未達(dá)到 柱過(guò)載情況時(shí)即為平頭峰，影響對(duì)最佳進(jìn)樣量的優(yōu) 化。此外，在目標(biāo)成分的最大吸收波長(zhǎng)下，干擾成分 的色譜峰很容易受到目標(biāo)成分色譜峰的影響，成為目標(biāo)成分色譜峰的前沿峰或拖尾峰，甚至被目標(biāo)成 分色譜峰掩蓋，不便于觀察收集。積雪草甙和羥基 積雪草甙為三萜皂苷類(lèi)成分，低波長(zhǎng)為其可用檢測(cè) 波長(zhǎng)。圖2為積雪草甙和羥基積雪草甙的紫外 可 見(jiàn)光吸收光譜，積雪草甙和羥基積雪草甙的最大吸 收波長(zhǎng)為199．5 nm，如在此波長(zhǎng)進(jìn)行制備，目標(biāo)色 譜峰在較少進(jìn)樣量時(shí)已經(jīng)表現(xiàn)為平頭，目標(biāo)色譜峰 與干擾成分峰相互干擾嚴(yán)重，無(wú)法準(zhǔn)確完成餾分收 集，所以本實(shí)驗(yàn)在220 nm檢測(cè)，可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

 2．2 產(chǎn)品的純度檢測(cè)

 2．2．1 熔點(diǎn)測(cè)定

 測(cè)得所制備的積雪草甙的熔點(diǎn)為231～232℃ ， 羥基積雪草甙的熔點(diǎn)為218～219℃ 。

 2．2．2 薄層色譜分析

 取產(chǎn)品與對(duì)照品溶液分別點(diǎn)于同一硅膠G板 上，上行展開(kāi)，展開(kāi)劑為氯仿一甲醇一水(體積比為7：3 ：0．5)，顯色劑為10％ 硫酸乙醇溶液，在110℃下加 熱至斑點(diǎn)清晰，產(chǎn)品在對(duì)照品相應(yīng)呈現(xiàn)的比移值處 顯相同顏色的斑點(diǎn)，在其他位置無(wú)斑點(diǎn)。

 2．2．3 高效液相色譜分析

 精密稱(chēng)取產(chǎn)品和對(duì)照品各10．0 mg，用少量流 動(dòng)相溶解并定容至10 mL，按照“1．2”節(jié)分析型色譜 條件分析。采用峰面積歸一化法定量，積雪草甙制 備品含量為98．49％，羥基積雪草甙制備品含量為 99．14％；采用外標(biāo)法定量，積雪草甙產(chǎn)品相對(duì)對(duì)照 品的含量為103．98％，羥基積雪草甙產(chǎn)品相對(duì)對(duì)照 品的含量為103．18％。本方法所制備的積雪草甙和 羥基積雪草甙相對(duì)對(duì)照品含量均大于103％，這是因 為購(gòu)買(mǎi)的對(duì)照品用于定性分析，含量低于98％，所以 采用外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果含量大于103％。圖3為經(jīng)制 備獲得的積雪草甙和羥基積雪草甙產(chǎn)品的HPLC純 度分析圖。

 3 結(jié)論

 對(duì)照品純度是中藥化學(xué)對(duì)照品的表征參數(shù)。作 為傳遞量值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，中藥化學(xué)品本身的純度對(duì) 被測(cè)物質(zhì)的量值準(zhǔn)確性是至關(guān)重要的。本實(shí)驗(yàn)采用 薄層色譜法、高效液相色譜法對(duì)對(duì)照品純度進(jìn)行純 度分析。采用歸一化法和外標(biāo)法進(jìn)行定量，積雪草 甙和羥基積雪草甙純度均達(dá)到98％ 以上。本方法 具有高效快速的特點(diǎn)，可以用于積雪草甙和羥基積 雪草甙對(duì)照品的制備，通過(guò)放大技術(shù)可以用于更大 規(guī)模對(duì)照品的制備。