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 關(guān)鍵詞:微量熱法 綠原酸 大腸桿菌 擬菌作用 熱譜曲線  上禾生物

 MICROCALORIMETRIC STUDY ON ANTIBACTERIAL ACTIVITIES OF CHLOROGENIC ACID FROM FLOS LONICERAE

 Abstract:Chlorogenic acid（CA）was extracted from Flos Lonicerae.Bacteriostasic activity of different concentrations of CA for E.coli was studied by Microcalorimetry.The relationship of thermal power and time of the Escherichia coil＇s metabolism at different concentrations of CA was determined.Logistic equation was used to calculate the growth rate constants（μ） for inhibiting bacterium.Therefore,the minimal inhibitory concentration（MIC） was confirmed.

 Key words:microcalorimetry;chlorogenic acid;Escherichia coli;metabolism of icroorganism;thermal power-time curves

 近年來(lái)，金銀花為主要原料的藥品具有抗病毒、消炎等療效，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥市場(chǎng)和臨床醫(yī)療．我們從金銀花中提取出 了有效成分綠原酸，用大腸桿菌做擬菌實(shí)驗(yàn)．這是依據(jù)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的各種代謝過(guò)程，都伴隨著能量的轉(zhuǎn)移和變化，用微量熱法 可連續(xù)測(cè)量細(xì)菌代謝過(guò)程所產(chǎn)生的熱量，得到整個(gè)代謝過(guò)程的熱活性信息 J．微生物代謝熱譜曲線代表著細(xì)菌代謝的特征， 反映了代謝過(guò)程中生理生化特征變化的情況．本文采用微量熱法研究了金銀花中有效成分綠原酸對(duì)大腸桿菌的擬菌特性，用 熱活性檢測(cè)儀測(cè)出不同濃度綠原酸下大腸桿菌生長(zhǎng)代謝的熱功率一時(shí)問(wèn)曲線，得到了該試驗(yàn)條件下的最佳擬菌濃度．

 1 微量量熱法對(duì)細(xì)菌的研究

 1．1 概 況

 細(xì)菌生長(zhǎng)的熱動(dòng)力學(xué)研究是物理化學(xué)研究的前沿課題_2]，它用微量熱法和熱動(dòng)力學(xué)原理來(lái)研究細(xì)菌的耐藥 性．目前細(xì)菌和病毒的種類繁多，而且繁殖速度極快，一些細(xì)菌和病毒幾乎能在任何藥物的攻擊下存活下來(lái)，就會(huì)把抗藥基因 遺傳給后代，隨著時(shí)間的推移，就會(huì)形成具有完全抗藥性的細(xì)菌．不同細(xì)菌的代謝都有自己的特性，同種細(xì)菌的代謝和試驗(yàn)條 件密切有關(guān)，如溫度、濃度等實(shí)驗(yàn)條件的改變必然導(dǎo)致代謝過(guò)程的改變．某種藥物濃度大或小都不一定最有效，何種濃度為最 適宜的擬菌濃度，具有足夠靈敏度的微量熱計(jì)可直接測(cè)量細(xì)菌的代謝活性，比較準(zhǔn)確地提供耐藥性的參數(shù)．通過(guò)細(xì)菌對(duì)中藥 耐藥性的測(cè)定，篩選藥物，指導(dǎo)用藥．

 1．2 原 理

 用熱活性檢測(cè)儀測(cè)定在此條件下，中藥提取物綠原酸對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程的熱功率——時(shí)間曲線，構(gòu)建 細(xì)菌生長(zhǎng)模型，計(jì)算出生長(zhǎng)速率常數(shù)，并確定生長(zhǎng)速率常數(shù)與藥物抑菌濃度的定量關(guān)系：細(xì)菌生長(zhǎng)模型． 非限制條件下細(xì)菌生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模型

 數(shù)據(jù)處理用Origin軟件中l(wèi) ogistic model， 方程形式為

生長(zhǎng)速率常數(shù)Y=0時(shí)，x為最小擬菌濃度，或最佳抑菌濃度(blIC)．

 2 實(shí)驗(yàn)部分

 2．1 實(shí)驗(yàn)儀器

 使用瑞典Themud MetricAB公司制造的八通道微量熱活性檢測(cè)儀(3114／3236TAM Air) ]．該儀器是用空氣來(lái)控 制體系溫度，并擁有8個(gè)通道．其主要包括測(cè)量系統(tǒng)、控溫系統(tǒng)、數(shù)據(jù)輸出系統(tǒng)．儀器是一種靈敏度較高的熱導(dǎo)式量熱儀，主要 用于研究溫度變化在5～60℃之間的反應(yīng)體系，可以連續(xù)監(jiān)測(cè)生物學(xué)、生物化學(xué)、化學(xué)、冶金、材料學(xué)中發(fā)生的慢反應(yīng)和慢過(guò) 程．其主要的檢測(cè)原理為：根據(jù)熱流原理，使樣品因物理變化或化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的熱迅速地流向維持在恒溫的環(huán)境．每一個(gè)通 道包括兩個(gè)測(cè)量筒(A為樣品，B為參比)，其中有兩個(gè)賽貝克熱傳感器，一個(gè)在樣品筒下面，一個(gè)在參比筒下面．樣品和它的環(huán) 境之間溫差引起的熱交換主要通過(guò)熱流傳感器，相應(yīng)地在該傳感器中形成一個(gè)正比于熱流速度的電勢(shì)信號(hào)．參比中裝有與樣 品熱容相同的物質(zhì)，兩者實(shí)行孿生式對(duì)接，這樣就消除了因外界溫度波動(dòng)產(chǎn)生的背景噪音．八通道微量熱活性檢測(cè)儀可輸出 1×10 W的功率，24 h基線漂移不超過(guò)2×10～W，恒溫工作范圍為5～60℃，可維持±0．02℃不變，測(cè)量范圍60 mW 和 600 mW兩檔，最大樣品體積24 III1．

 八通道微量熱活性檢測(cè)儀測(cè)量方式主要有兩種：安瓶法、滴定法．根據(jù)測(cè)量體系狀態(tài)的不同，或?qū)嶒?yàn)過(guò)程檢測(cè)要求的不同可以選擇不同的測(cè)量方式．滴定法適用于在實(shí)驗(yàn)過(guò)程當(dāng)中需要加入藥品的實(shí)驗(yàn)，安瓶法適用于固體、半固體和液體樣品；本實(shí) 驗(yàn)主要用安瓶法，實(shí)驗(yàn)溫度為37℃，首先將安瓶放人滅菌臺(tái)上消毒15 min，然后取一支培養(yǎng)基接菌并全部倒人安瓶中，封El放 人儀器中，開(kāi)始記錄實(shí)驗(yàn)，當(dāng)細(xì)菌代謝的熱功率—— 時(shí)間曲線回到基線時(shí)，即認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)束．

 2．2 試劑和中藥

 乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、活性炭、金銀花由曲阜中草藥批發(fā)站提供，產(chǎn)地為臨沂，為忍冬／on／zerae japonica Thunb的干燥花蕾．

 大腸桿菌由山東省衛(wèi)生防疫站提供．采用牛肉膏湯液體培養(yǎng)基，其成分為蛋白胨2．O0 g，氯化鈉2．O0 g，牛肉浸膏1．O0 g， 蒸餾水200．O0 ml，調(diào)pH值7．2～7．4，過(guò)濾后分裝在潔凈試管中，每支試管盛8．O0 m1．然后用l2l℃蒸汽滅菌30 min，冷卻后置 冰箱備用 J．

 2．3 耐藥菌培養(yǎng)

 將大腸桿菌用接菌環(huán)接兩環(huán)到8．O0 ml培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)12 h，12 h后接菌到同樣濃度的藥液中在同 樣條件下培養(yǎng)．

 3 研究?jī)?nèi)容

 3．1 中藥有效成分的提取

 選用中草藥金銀花，對(duì)中草藥的有效成分進(jìn)行提取 ]，采用減壓、蒸發(fā)、濃縮、分離、萃取等方法進(jìn) 行純化，從而得到所需物質(zhì)綠原酸，綠原酸是含有羥基和鄰二酚基的有機(jī)酸，極性與乙醇相對(duì)接近，所以含有乙醇的溶媒更易 有效的提取出綠原酸}4]．具體做法為：

 1) 稱取200 g金銀花，粉碎后用800 ml水熱浸1．5 h，溫度保持40—50℃；在同樣溫度下用600．00 ml水熱浸1 h；用 400．00 ml水熱浸O．5 h；3次濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至80．00 II1l毫升．分4次加入95％的乙醇150．00 ml，每次振蕩洗滌 梨型瓶．將液體倒人抽濾瓶抽濾，在35℃用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去乙醇(回收)

 2) 在較黏稠濾液中加入25．00 rI1l石油醚，用超聲波震蕩器振蕩，不分離，將濾液倒人抽濾瓶抽濾．

 3) 抽濾后的液體加入乙酸乙酯5O．00 II1l、50．00 II1l、50．00 I1l，分層以前要不斷震蕩，在分液漏斗上層分出黃酮類化合物， 下層放出的液體主要為綠原酸．

 4) pH值的變化對(duì)綠原酸的提取影響很大，這與綠原酸本身是一種有機(jī)酸有關(guān) ．調(diào)整pH 2～3，將液體加入正丁醇 20．00 I1l、20．00 II1l、40．00 I1l、萃取3次，(需要放置5～6 h)將萃取液合并約150．00 ml(A)，中間層土黃不透明液體里再加入 25．00 rnl正丁醇、再次分離出的液體合并與(A)．

 5) 將A液體置于500．00 ml梨型瓶旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去正丁醇，得到少許浸膏．加水溶解后用少量活性炭脫色，過(guò)濾，蒸去 水分，放置于40～50℃烘箱中烘干．

 3．2 實(shí) 驗(yàn)

 用甲醇將綠原酸對(duì)照品配制成3．00、6．00、12．00、 l5．00、24．00、3O．00 mg·L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng) 324腫下測(cè)得綠原酸含量39．5％ ．用電子秤稱取1．20 mg綠原酸粗 品，在lO．00 II1l容量瓶中溶解．本實(shí)驗(yàn)用安瓶法，打開(kāi)儀器，當(dāng)儀器 穩(wěn)定在37℃并且基線穩(wěn)定后，將安瓶放在滅菌臺(tái)上消毒15 min．待 儀器基線穩(wěn)定后，取滅菌后的盛有8．00 ml培養(yǎng)基的試管8支，加 入不同體積的藥液，0．10、0．20、0．50、0．60、0．70、0．80、0．90、1．00 ml 配成0．014 5、0．029 27、0．071 59、0．o83 72、0．096 55、0．109 0、0．121 3．0．133 3 g·L 的綠原酸大腸桿菌溶液．然后以無(wú)菌手續(xù)接種標(biāo)準(zhǔn) 菌種，搖勻，即為混懸液，移人8個(gè)安瓶中，封口后放人儀器中預(yù) 熱，待恒溫后，測(cè)量并記錄安瓶?jī)?nèi)大腸桿菌在藥物作用下代謝的熱 功率一時(shí)問(wèn)曲線，待曲線回到基線后，即認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)束．

 3．3 測(cè)熱譜曲線(見(jiàn)圖1)

 圖1大腸桿菌在不同濃度綠原酸下的熱動(dòng)曲線

 4．1 計(jì)算生長(zhǎng)速率常數(shù)

 將試驗(yàn)中綠原酸的濃度C(ch1)g·L～；生長(zhǎng)速率常數(shù)u／trim 和相關(guān)系數(shù)r列于表1．

 表1 大腸桿菌在不同濃度綠原酸作用下的生長(zhǎng)速率常數(shù)

 當(dāng)細(xì)菌的代謝熱功率一時(shí)間曲線返到基線即認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大約需要lO～l2 h．測(cè)定了37℃時(shí)，不同濃度(c)的Chl對(duì)大 腸桿菌代謝作用的熱功率一時(shí)間曲線．計(jì)算出生長(zhǎng)速率常數(shù)．

 4．2 最小抑菌濃度

 在細(xì)菌代謝的指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)菌群體生長(zhǎng)模型遵循logistic方程．用熱活性檢測(cè)儀測(cè)出不同濃度綠原酸中大腸桿菌生長(zhǎng)代謝的熱功率一時(shí)問(wèn)曲線，即Pt—t曲線，用logistic方程處理該曲線上的數(shù)據(jù)，由表1數(shù)據(jù)可確立 一c的 關(guān)系．計(jì)算得到ch1的最小抑菌濃度MIC為13．20 nag·L～．

 另外有報(bào)道 J，綠原酸中加入口一環(huán)糊精可以有效的防止水解的 產(chǎn)生．隨著綠原酸藥物濃度的增加抑菌作用逐漸增強(qiáng)，綠原酸在高濃 度時(shí)對(duì)大腸桿菌有明顯的擬菌效用，但有時(shí)當(dāng)濃度極低時(shí)反而轉(zhuǎn)化為 促菌作用，這說(shuō)明中藥成分的復(fù)雜性．

 圖2 Chl對(duì)大腸桿菌代謝作用的熱譜曲線

 隨著各種抗菌素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題變得越來(lái)越突 出，幾乎所有的細(xì)菌都有各自對(duì)抗各種抗生素的耐藥株型 J．一些中 草藥復(fù)方制劑和中草藥提取物制劑的療效與青霉素等抗生素相當(dāng)，有 的療效甚至高于抗生素，且不存在耐藥性和藥殘問(wèn)題．我國(guó)的中藥藥 源廣、種類多、使用方便、價(jià)格便宜，復(fù)方制劑在治療及預(yù)防人畜疾病 有巨大作用．因此，大力開(kāi)發(fā)中藥，優(yōu)化提取工藝，確定有效成分及其 作用機(jī)理，研制新型獸藥防治畜禽疾病，具有良好的發(fā)展前景．

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