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復(fù)方杜仲口服液對(duì)小鼠免疫功能的影響

發(fā)布時(shí)間:2013-06-07 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):1736

復(fù)方杜仲口服液是以杜仲葉、桑葉為主要原料經(jīng)提取制成的中藥保健產(chǎn)品。研究資料表明：杜仲葉和桑葉提取物分別具有多種保健功能，杜仲葉具有降壓、抗衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用¨ ；桑葉提取物桑葉黃酮具有降血糖的作用等等。本文對(duì)復(fù)方杜仲口服液對(duì)免疫功能的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1．1 藥品復(fù)方杜仲口服液：為棕褐色液體，人體推薦量為每人每日500ml成品，由三原華州醫(yī)藥生物工程生產(chǎn)基地生產(chǎn)，批號(hào)：2008103。由于人體攝入量較大，故該實(shí)驗(yàn)將受試物減壓濃縮(65℃)成濃縮液(1：9)，本研究采用濃縮液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并按濃縮液進(jìn)行劑量設(shè)計(jì)。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)昆明種小鼠200只，雌性，體重18～ 22g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK(軍)2007—007號(hào)。動(dòng)物室溫度22～24℃ ，濕度45％～ 55％。動(dòng)物房使用許可證號(hào)：SYXK(陜)2007—004號(hào)。 1．3 儀器與試劑高壓滅菌器、超凈工作臺(tái)、CO 恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、752N紫外可見分光光度計(jì)、BIO—RAD酶標(biāo)儀、離心機(jī)、24孔培養(yǎng)板、96孔培養(yǎng)板、游標(biāo)卡尺。綿羊紅細(xì)胞(SRBC)、雞紅細(xì)胞、YAC一1細(xì)胞、印度墨汁、MTr液、 ConA、RPblI1640培養(yǎng)液、乳酸鋰、硝基化氯氮唑(iTw)、吩嗪二甲酯硫酸鹽、"Iris—HC1等。

1．4 分組及給藥將200只雌性小鼠分為5組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組40只并隨機(jī)分為4組，空白組及復(fù)方杜仲口服液 18．52ml／kg、9．26ml／kg和4．63ml／kg(分別相當(dāng)于人體推薦成品用量的2O、1O和5倍)組，空白組予蒸餾水。每組10 只。每天灌胃1次。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用方差分析。

1．6 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)測定于灌胃第26天，給小鼠腹腔注射2％綿羊紅細(xì)胞(SRBC)0．2ml／只進(jìn)行致敏，于免疫后第4天小鼠左后足跖部皮下注射20％SRBC(20 ／只)進(jìn)行攻擊。并于攻擊前和攻擊后24小時(shí)測量小鼠左后足跖同一部位厚度，計(jì)算攻擊前、后的差值。

1．7 ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)MTr法。對(duì)各組小鼠無菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整脾細(xì)胞濃度為3×10 A／mt，按照程序中MTr法進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，最后在752N紫外可見分光光度計(jì) 570nm波長處測其光密度值(OD)，計(jì)算ConA 與ConA一各孔的光密度差值。

1．8 NK細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)將YAC一1細(xì)胞 (靶細(xì)胞)傳代培養(yǎng)，以Hank’S液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4 x 10 ~-／ml(活細(xì)胞>95％)。對(duì)各組小鼠無菌取脾，制脾細(xì)胞懸液(效應(yīng)細(xì)胞)，用RPMI1640 完全培養(yǎng)液調(diào)整脾細(xì)胞濃度為2×10 個(gè)／L(活細(xì)胞 >95％)。取靶細(xì)胞和脾細(xì)胞懸液各100- 加入96孔u(yù)型培養(yǎng)板中(效靶比50：1)，并設(shè)靶細(xì)胞自然釋放孔和最大釋放孔，各項(xiàng)均作3個(gè)平行孔。5％CO 培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4 小時(shí)、離心(1500r／min)5分鐘。每孔吸取上清100I 置96 孔平底培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100 ，反應(yīng)7分鐘后每孔加入1 mol／L的HE130 ，用酶標(biāo)儀在490nm處測定光密度值(OD)，計(jì)算NK細(xì)胞活性轉(zhuǎn)換值。

1．9 血清溶血素測定于灌胃第26天給小鼠腹腔注射2％ SRBC(0．2ml／只)，于免疫后第4天摘眼球采血，分離血清并在微量血凝板上進(jìn)行血清溶血素測定，37℃孵育3小時(shí)后，統(tǒng)計(jì)血球凝集度，計(jì)算相應(yīng)抗體積數(shù)。

1．10 抗體生成細(xì)胞(PFC)檢測于灌胃第26天給小鼠腹腔注射2％SRBC(0．2ml／只)，于免疫后第4天處死，解剖取脾制備脾細(xì)胞懸液，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整脾細(xì)胞濃度為5 x 10 個(gè)／fnl。按程序方法制備瓊脂糖玻片，在二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃ 、5％CO )中溫育1．5小時(shí)后加補(bǔ)體，再溫育 1．5小時(shí)，計(jì)數(shù)每張瓊脂薄層玻片上形成的溶血空斑數(shù)并計(jì)算成l0 個(gè)脾細(xì)胞周圍的溶血空斑數(shù)。

1．11 碳廓清實(shí)驗(yàn)按順序給各組小鼠尾靜脈注射印度墨汁(4倍稀釋)0．1ml／10g。每鼠均于注射墨汁后2分鐘及1O 分鐘分別準(zhǔn)時(shí)內(nèi)眥采血20 ，并迅速加入到2ml 0．1％碳酸鈉溶液中并搖勻，以752N紫外可見分光光度計(jì)600nm波長處測光密度值(OD)。同時(shí)取小鼠肝、脾稱重，按公式計(jì)算吞噬指數(shù)(a)。

1．12 雞紅細(xì)胞吞噬試驗(yàn)于末次給藥后各組小鼠均腹腔注射20％雞紅細(xì)胞懸液(1ml／只)，間隔3O分鐘處死小鼠，腹腔注人生理鹽水2ml／只，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1分鐘后吸取腹腔洗液制片，37~C溫育3O分鐘，漂洗、晾干、固定后染色鏡檢。計(jì)數(shù)吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)和巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞數(shù)，計(jì)算吞噬率轉(zhuǎn)換值和吞噬指數(shù)。

1．13 統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 ±s表示，采用方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果

2．1 對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響結(jié)果見表1。

2．2 對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能及NK細(xì)胞活性的影響結(jié)果見表2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：復(fù)方杜仲口服液可抑制小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能及NK細(xì)胞活性，提高血清溶血素水平，促進(jìn)抗體細(xì)胞形成，說明其具有增強(qiáng)免疫功能作用。

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