蘿卜硫甙的分離純化 | 蘿卜硫甙的分離純化 |
| 發(fā)布時(shí)間:2013-07-25 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):2419 |
由于植物中含有多種硫苷，且在結(jié)構(gòu)上具有相似性，該類化合物的分離純化較為困難。迄今位置，國(guó)內(nèi)外對(duì)硫苷的的特性及分析方法的研究報(bào)道較多，而對(duì)硫苷的分離純化報(bào)道較少，且沒(méi)有一種統(tǒng)一的硫苷分離純化工藝。本文通過(guò)理論分析，確定蘿卜硫苷的分離純化方法。 1 浸提溶劑的選擇 溶劑的影響是通過(guò)溶劑的溶解度、親和力、粘度、分子大小等各種因素綜合起作用的，其對(duì)浸提率和浸提速率的影響較大。提取溶劑的選擇主要根據(jù)溶劑的極性和蘿卜硫苷及其共存雜質(zhì)的性質(zhì)來(lái)決定。一般要求選擇的溶劑：能選擇性地溶解蘿卜硫苷，使產(chǎn)品純度提高；化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)設(shè)備無(wú)腐蝕作用；溶劑沸點(diǎn)低，濃縮方便，回收容易；安全、無(wú)毒、對(duì)人體無(wú)害。目前大部分提取硫苷采用甲醇沸騰法，有效防止硫苷在含水量高的環(huán)境中發(fā)生降解，并且能夠除去一些親水性的蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，但是提取率不高。由于蘿卜硫苷易溶于水，可以考慮用甲醇、水混合溶劑提取。 2 初提物的分離純化方法 目前硫苷分離純化的方法主要有凝膠色譜法和離子交換色譜法。 （一）凝膠色譜法（Gel chromatography）：是利用某些凝膠對(duì)不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異，進(jìn)行分離的技術(shù)。對(duì)于硫苷的分離純化一般選用羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20），分離原理主要有兩方面：以凝膠過(guò)濾作用為主，兼具反向分配的作用。因?yàn)槟z過(guò)濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來(lái)，小分子的化合物保留強(qiáng)，最后出柱。如果使用反相溶劑洗脫，Sephadex LH-20對(duì)化合物還起反向分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來(lái)，極性小的化合物保留強(qiáng)，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過(guò)濾作用來(lái)分離。凝膠色譜法要求流動(dòng)相流速不可太快，餾分一定要接的細(xì)，1/10或1/20個(gè)保留體積接成一餾分。 （二）離子交換色譜（Ion-exchange chromatography）：是利用離子交換劑作為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離的方法。離子交換劑實(shí)際上是含有堿性基團(tuán)或酸性基團(tuán)的高聚物，如取代酚及氨基酚與甲醛的縮合物、磺化酶或磺化聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸等。 離子交換劑分為兩類： (1)陽(yáng)離子交換劑：呈酸性，含有-SO3H、-CH2SO3H、-COOH或-OH(酚羥基)等酸性基團(tuán)，具有交換陽(yáng)離子的能力。 (2)陰離子交換劑：呈堿性，含有-NH2或＝NH或-N(CH)3+X—等堿性基團(tuán)，具有交換陰離子的能力。 用合成的方法可以得到各種活性不同的離子交換劑，用這些離子交換劑，并同時(shí)采用不同 pH 值的溶液，可從混合物中選擇性地提出各種酸、堿或鹽類。根據(jù)操作技術(shù)和應(yīng)用的差別，離子交換色譜一般可分為三種類型，即：淋洗色譜、置換色譜和前沿色譜。其中只有淋洗色譜才能應(yīng)用于分析化學(xué)中做定量分離分析，而置換色譜則是大量性質(zhì)相似元素分離制備的有效方法，前沿色譜因只有首先流出的組分可以獲得部分純的組成，所以到目前為止，研究應(yīng)用也很少。 凝膠色譜法的分離效果不易控制，且餾分的收集分析步驟繁瑣。硫苷分子中含有的硫酸根離子使硫苷分子具有很強(qiáng)的極性，故選擇離子交換色譜法對(duì)初提物進(jìn)行分離純化。離子交換色譜法的關(guān)鍵在于固定相與洗脫劑的選擇。 2.1 離子交換樹(shù)脂的選擇 常用于硫苷分離純化的離子交換劑主要有三種：D315樹(shù)脂、717型陰離子交換樹(shù)脂和DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝膠。 1）D315樹(shù)脂是一種大孔的陰離子交換樹(shù)脂，分子容易深入其顆粒內(nèi)部進(jìn)行交換，所以對(duì)硫苷離子的交換率較高；其交換官能團(tuán)為C≡N，交換能力沒(méi)有季銨陽(yáng)離子的強(qiáng)，特別是對(duì)極性小的分子或離子的交換能力不強(qiáng)。 2）717型是一種普通的強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂，其顆粒內(nèi)部孔徑小，使硫苷分子不容易深入到顆粒內(nèi)部進(jìn)行交換，而色素分子的交換率較高，其原因可能是因?yàn)樯氐姆肿影霃捷^小。同時(shí)由于其官能團(tuán)是季銨陽(yáng)離子形式，硫苷離子一旦交換上去又不容易被洗脫，不利于硫苷離子的富集。 3）DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝膠的陰離子交換特異性很強(qiáng)，對(duì)硫苷離子的交換率很高，是油菜籽中硫苷測(cè)定方法中規(guī)定使用的陰離子交換劑，但是價(jià)格較昂貴。 .2.2 洗脫劑的選擇 陰離子交換劑常用的洗脫劑為鹽或弱堿溶液，其交換能力隨pH變化而變化，pH越低，交換能力越大。通常強(qiáng)堿性交換劑流動(dòng)相的pH值應(yīng)小于12，弱堿性應(yīng)小于7。由于堿溶液對(duì)陰離子交換劑的親和力較弱，須用較高濃度，而鹽溶液對(duì)陰離子交換劑的親和力較強(qiáng)，容易洗脫出目標(biāo)物。蘿卜硫苷分子中含有SO42-，并常以鉀鹽的形式存在，所以選擇合適濃度的硫酸鉀溶液作為洗脫劑。 .3 蘿卜硫苷的精細(xì)純化方法 原則上通過(guò)離子交換色譜分離后的被分離組分已經(jīng)具有較高純度，但由于原料中雜質(zhì)的含量較高，通過(guò)一次離子交換色譜分離無(wú)法得到純度很高的蘿卜硫苷單體。為了得到高純度的蘿卜硫苷單體，上述離子交換色譜分離后得到的目標(biāo)物需要進(jìn)一步的純化。高效液相色譜法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）是目前最有效的獲得單一硫苷產(chǎn)品的純化方法。 4 蘿卜硫苷的檢測(cè)分析 目前國(guó)際上還沒(méi)有統(tǒng)一的蘿卜硫苷測(cè)定方法，最常用的硫苷分析方法是反向高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS），但是這種方法需要使用昂貴的硫酸酯酶對(duì)硫苷進(jìn)行脫硫處理，并且耗時(shí)很長(zhǎng)。 甲酸能作為 HPLC 的離子對(duì)試劑，使蘿卜硫苷較好的分離。蘿卜硫苷的HPLC 分析檢測(cè)條件：色譜柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-AP(5μm，4.6mm×200mm)；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：229nm；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：乙腈:水=2:98，含 0.1%甲酸。蘿卜硫苷色譜峰的初步質(zhì)譜鑒定結(jié)果：高效液相色譜圖中保留時(shí)間約為 4min 的峰為蘿卜硫苷。 |
