999国内精品视频免费_国产真人作爱免费视頻_口口亚洲国产综合Av_99Re国产精品视频

   摘　要:　采用高效液相色譜(HPLC)法對我國隴南地區(qū)引種的油橄欖不同部位中山楂酸的含量分布進行了系統(tǒng)研究,建立了油橄欖不同部位中山楂酸含量的測定方法。用KromasilC18柱(250mm×4. 6mm, 5μm),以甲醇-1. 0%醋酸水溶液(體積比88∶12)為流動相,檢測波長為215 nm。結(jié)果顯示,油橄欖全果中含山楂酸0. 16%,果肉中含0. 17%,橄欖葉中含0. 73%,油橄欖枝條表皮中含0. 31%,油橄欖果渣中含0. 41%,而果核和油橄欖枝條木質(zhì)部中則沒檢出山楂酸。在含有山楂酸的各個部位中,山楂酸的平均加標回收率分別為94. 1%、93. 9%、95. 5%、92. 3%和94. 7% (n=3),相對標準偏差(RSD)分別為2. 12%、1. 85%、2. 03%、1. 69%和1. 34% (n=3);山楂酸進樣量在3. 15~36. 6mg/L范圍內(nèi)線性良好。

關(guān)鍵詞:　高效液相色譜法;油橄欖;山楂酸

油橄欖(Olea europaeaLinn. ),又名齊墩果,為木犀科,在《本草綱目》中就有記載,原產(chǎn)于西班牙、意大利和希臘,我國甘肅隴南地區(qū)也開展了規(guī)�；�種植工作。山楂酸是一種齊墩果烷型五環(huán)三萜酸,主要存在于山楂油橄欖果實的蠟質(zhì)表皮、油橄欖葉以及油橄欖果渣中,在枇杷葉、蘋果果皮、鼠尾草等中也有存在,具有抗腫瘤、抗艾滋病毒、抗炎、抗菌、抗寄生蟲、減肥和保健美容等多種生物活性。溫小安等研究發(fā)現(xiàn),山楂酸可顯著對抗腎上腺素、葡萄糖引起的血糖升高,對抗腎上腺素引起的肝糖原降解。Ana等研究表明從油橄欖提取出的天然成分山楂酸在體外培養(yǎng)細胞中有明顯抗氧化性能。Fernando等研究發(fā)現(xiàn)山楂酸能夠明顯抑制Bc-l 2的表達而增加Bax蛋白,又能刺激線粒體細胞色素-C的釋放并激活半胱天冬氨酸酶-9和半胱天冬氨酸酶-3,顯著地抑制細胞增殖并導致癌細胞凋亡,從而可以治療結(jié)腸癌;Andrés等研究發(fā)現(xiàn)山楂酸能夠抑制絲氨酸蛋白酶,而艾滋病病毒正是利用這種酶將自身從被感染的細胞中向外部釋放,擴散至病毒感染者全身。此外山楂酸還可用于乳腺癌、皮膚癌以及其他類型腫瘤的治療。山楂酸已經(jīng)成為國內(nèi)外研究熱點之一,對其藥理藥效的研究已有很多報道。Vassiliki等通過熒光法測定了初榨橄欖油、橄欖果以及橄欖葉中的總酚類化合物;Sánchez等[13]采用LC-LC-MS法測定微波輔助提取的橄欖葉中三萜類化合物;而對油橄欖各個部位中山楂酸的含量測定的研究則不多。作者建立了山楂酸的測定方法,并首次對我國隴南地區(qū)引種的油橄欖不同部位山楂酸的分布進行了系統(tǒng)的研究,以期篩選合適的原料作為進一步制備山楂酸單體的來源。

1材料與方法

1.1材料與試劑

油橄欖果實、橄欖葉、橄欖枝條以及橄欖果渣均采于甘肅省隴南市武都區(qū)油橄欖種植基地;山楂酸由本實驗室自制,純度99%;甲醇,色譜純;正己烷、無水乙醇、95%乙醇,均為分析純;水為二次蒸餾水。

1.2儀器與設(shè)備

Agilent1100高效液相色譜儀,包括:真空脫氣機,四元泵,自動進樣器,恒溫柱溫箱,紫外檢測器,HP化學工作站等,美國安捷倫公司;DHG型智能電熱鼓風干燥箱,南通嘉程儀器有限公司; SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海申勝生物技術(shù)有限公司;高速萬能粉碎機,天津泰斯特儀器有限公司;十萬分之一電子分析天平,索氏提取器等。

1.3方法

1.3.1液相色譜條件　KromasilC18色譜柱(250mm×4. 6mm, 5μm);流動相為甲醇-1. 0%醋酸水溶液(體積比88∶12);流速1. 0mL/min;檢測波長215 nm;洗脫方式為等度洗脫;柱溫30℃;進樣方式為自動進樣;進樣量10μL。

1.3.2樣品前處理　取部分橄欖果,用干凈的刀片把果肉與果核分開,洗凈果核,分別干燥。把橄欖枝條表皮與木質(zhì)部剝開,分別干燥。同樣干燥橄欖全果、橄欖葉及果渣。把上述干燥的各樣品在高速粉碎機里粉碎成粉末,備用。

1.3.3　供試液制備　采用索氏提取法對樣品進行處理,一方面節(jié)省了溶劑,另墨幽中文一方面又能夠把目標成分基本提取完全,使測定值能最大程度的接近真實值。把按照1.3.2節(jié)方法所得的各樣品粉末干燥至質(zhì)量恒定,準確稱取一定量的橄欖果實粉末、果肉粉末和橄欖果渣粉末,用濾紙包扎好放入索氏提取器內(nèi),加入適量正己烷進行加熱回流脫油至基本無色,渣層干燥除凈正己烷后加入適量的80%乙醇溶液進行加熱回流至基本無色。橄欖葉粉末、橄欖枝條表皮、果核以及枝條木質(zhì)部粉末用80%乙醇溶液直接索氏提取。把上述7種樣品提取液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,用80%乙醇溶液定容至刻度,備用。

1.3.4  配制對照品溶液　準確稱取10mg山楂酸對照品于10mL容量瓶中,用95%乙醇溶解,超聲波處理5min,定容至刻度,即得1. 0 g/L的對照品溶液,備用,其色譜圖如圖2所示,山楂酸的出峰時間在12min左右。

1.3.5　樣品溶液的制備　取上述各樣品醇提液25mL于50mL容量瓶中,用80%乙醇溶液定容至刻度,即得樣品溶液,待測。

1.3.6　標準曲線的繪制　取對照品溶液2、4、6、8、10μL分別進樣,按上述色譜條件測定峰面積積分值,以峰面積積分值為縱坐標,對照品進樣量為橫坐標,繪制標準曲線:Y=357.02X+33.17, r=1. 000 0;線性范圍為3. 15~36. 6mg/L。

2　結(jié)果與分析

2.1　樣品預處理方式對含量檢測的影響

油橄欖果肉中橄欖油的含量豐富,對于目標物的提取測定有一定的影響。實驗中對比研究了用正己烷回流脫油與不脫油兩種處理方式。結(jié)果表明,未進行脫油處理的樣品由于油脂分子的包裹作用,使得其與提取溶劑的接觸面積減小,導致目標成分山楂酸不能提取完全,從而使得檢測值偏低;鑒于山楂酸在正己烷中微溶,設(shè)計了加標回收率實驗。實驗結(jié)果表明采用正己烷脫油預處理對目標成分的測定在誤差允許范圍內(nèi),符合檢測要求,所以實驗前對油橄欖果實、果肉以及果渣等含油豐富的樣品進行了正己烷脫油處理。

2.2　精密度實驗

精密吸取油橄欖果樣品溶液、果肉樣品溶液、橄欖葉樣品溶液、橄欖枝條表皮樣品溶液以及油橄欖果渣樣品溶液各10μL,重復進樣6次,峰面積積分值的相對標準偏差(RSD)分別為1. 21%、0. 98%、0. 97%、1. 30%和1. 05%,表明該方法精密度良好。

2.3　重現(xiàn)性實驗

準確稱取上述含有山楂酸的樣品粉末各5份,按照1.3.3和1.3.5節(jié)方法制得樣品溶液,分別進樣,山楂酸峰面積積分值的RSD分別為3. 32%、3. 53%、2. 47%、4. 65%和4. 36%,表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.4　穩(wěn)定性實驗

取上述7種樣品溶液,放置0、1、2、4、8、24、48、72 h,分別進樣10μL,根據(jù)每個樣品進樣8次檢測所得山楂酸峰面積積分值計算,其RSD分別為2. 02%、2. 31%、1. 89%、1. 85%、1. 76%、0. 87%和0. 99%。結(jié)果表明,樣品溶液常溫下在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5　不同樣品中山楂酸含量分析

準確吸取各樣品溶液10μL,按上述色譜條件分析檢測,外標曲線法計算山楂酸的含量。結(jié)果表明,油橄欖全果中含山楂酸0. 16%,果肉中含0. 17%,橄欖葉中含0. 73%,油橄欖枝條表皮中含0. 31%,油橄欖果渣中含0. 41%,而果核和油橄欖枝條木質(zhì)部中則沒檢出山楂酸。油橄欖果實、果渣以及油橄欖葉溶液的色譜圖如圖3(a~c)所示。

2.6 加標回收率實驗

稱取已知含量的橄欖全果粉末、橄欖果肉粉末、橄欖葉粉末、橄欖枝條表皮粉末以及橄欖果渣粉末各3份,每份3. 0 g,按照1.3.3和1.3.5節(jié)方法制得樣品溶液,分別加入山楂酸對照品2mg,超聲波處理使其溶解。按上述色譜條件進樣測定,計算回收率。結(jié)果表明山楂酸的平均回收率分別為94. 1%、93. 9%、95. 5%、92. 3%和94. 7% (n=3), RSD分別為2. 12%、1. 85%、2. 03%、1. 69%和1. 34%。

2.7　討論

研究表明,國產(chǎn)油橄欖中山楂酸的含量豐富,比西班牙產(chǎn)油橄欖原料含量略偏低,但性質(zhì)相近且雜質(zhì)較少,可作為制備高純度山楂酸的原料。因此該項研究為我國油橄欖的開發(fā)利用、高純度山楂酸的制備及有關(guān)抗癌藥物的研制提供了可靠的實驗和理論基礎(chǔ)。

3　結(jié)論

3.1　采用HPLC法建立了油橄欖及其相關(guān)部位中山楂酸含量的測定方法,其色譜條件為:色譜柱KromasilC18柱(250mm×4. 6mm, 5μm);流動相為MeOH-1. 0%HAc水溶液(88∶12,體積比);檢測波長215 nm;流速1. 0mL/min。

3.2　HPLC法測定結(jié)果顯示,油橄欖全果中含山楂酸0. 16%,果肉中含0. 17%,橄欖葉中含0. 73%,油橄欖枝條表皮中含0. 31%,油橄欖果渣中含0. 41%,而果核和油橄欖枝條木質(zhì)部中則沒檢出山楂酸。

3.3　油橄欖全果、果肉、葉、枝條表皮和果渣中山楂酸的加標回收率分別為94. 1%、93. 9%、95. 5%、92. 3%和94. 7%,相對標準偏差(RSD)分別為2. 12%、1. 85%、2. 03%、1. 69%和1. 34%。表明所建立的該測定方法可用于油橄欖及相似植物中相關(guān)部位山楂酸含量的測定。