高效液相色譜法測(cè)定山楂中的苦杏仁甙 | 高效液相色譜法測(cè)定山楂中的苦杏仁甙 |
| 發(fā)布時(shí)間:2013-10-18 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):2166 |
摘要:建立了從山楂中提取苦杏仁甙的方法,樣品先用石油醚脫脂,然后用甲醇進(jìn)行索氏提取。用高效液相色譜法定量測(cè)定了山楂中的苦杏仁甙,色譜條件如下:反相C18柱,流動(dòng)相為15%的甲醇水溶液,檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。測(cè)定了含不同比例山楂籽的山楂樣品,結(jié)果表明含山楂籽比例高的山楂樣品中苦杏仁甙的含量高,且山楂粗粒樣品中苦杏仁甙的提取量比粉末樣品的提取量高。 關(guān)鍵詞:高效液相色譜法;索氏提取;超聲提取;苦杏仁甙;山楂 苦杏仁甙(amygdalin,化學(xué)名為苯羥基乙氰-β-D-葡萄糖-6-β-D-葡萄糖甙,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)屬于芳香族甙,是維生素B17的主要成分,它廣泛存在于薔薇科植物的種子中。在苦杏仁甙酶的作用下苦杏仁甙將分解產(chǎn)生氫氰酸,對(duì)呼吸中樞產(chǎn)生一定的抑制作用,起到鎮(zhèn)咳平喘的功效。盡管少量的氫氰酸能止咳,但在人體內(nèi)積累到一定量后氫氰酸會(huì)和細(xì)胞線(xiàn)粒體中的氧化酶反應(yīng)而抑制酶的活性,進(jìn)而抑制組織細(xì)胞的呼吸作用而致人死亡。因此必須限定苦杏仁甙在食物、藥物中的含量。
檢測(cè)苦杏仁甙的方法主要是高效液相色譜法(HPLC),其他的檢測(cè)方法雖然也有報(bào)道,如氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法等等,但HPLC以其分離效率高、分析速度快而成為最通用的方法。HPLC方法常選用反相C18柱作為分離柱,不同濃度的甲醇(或乙腈)水溶液作為流動(dòng)相,采用紫外檢測(cè)。山楂為薔薇科植物山楂紅(Crataegus pinnatifida Bge. var.majorN. E. Br. )或野山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)的干燥成熟果實(shí),其主要成分包括有機(jī)酸和黃酮類(lèi)化合物等,對(duì)這些成分的研究已有不少報(bào)道。日本等國(guó)家已經(jīng)開(kāi)始對(duì)從中國(guó)進(jìn)口的山楂提出測(cè)定苦杏仁甙含量的要求,但是現(xiàn)在并未發(fā)現(xiàn)關(guān)于山楂中苦杏仁甙檢測(cè)方法的報(bào)道。本文的研究目的就是優(yōu)化山楂中苦杏仁甙的提取方法,建立山楂中苦杏仁甙的HPLC定量分析方法。本文用石油醚對(duì)山楂進(jìn)行脫脂后用甲醇提取苦杏仁甙,并用HPLC對(duì)山楂中的苦杏仁甙含量進(jìn)行檢測(cè)。 1 實(shí)驗(yàn)部分 1.1 儀器及色譜條件 美國(guó)惠普公司HP1100系列高效液相色譜儀,由四元梯度泵、二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、HP化學(xué)工作站和在線(xiàn)脫氣裝置組成。色譜柱為Agilent C18柱(250mm×4·6mm i·d·,5μm )。流動(dòng)相為15% (體積分?jǐn)?shù))的甲醇水溶液,流速為0·8mL/m in,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm,柱溫為30℃,進(jìn)樣量為20μL。所有樣品均經(jīng)0·45μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。 1.2 樣品與試劑 山楂樣品由天津雙勛堂藥業(yè)公司提供,苦杏仁甙標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純。 1.3 樣品處理 實(shí)驗(yàn)中所用山楂樣品共5種:山楂粉、含7%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)山楂籽的山楂粉(在山楂粉中添加7%山楂籽粉末,下同)、含20%山楂籽的山楂粉、山楂粗粒(粉碎時(shí)過(guò)篩出來(lái)的粗顆粒)和含24%粗粒的山楂粉(在山楂粉中添加24%過(guò)篩出來(lái)的粗顆粒)。取5種山楂樣品各1g,浸泡在10mL石油醚中,超聲提取15m in。過(guò)濾后將殘?jiān)?00mL甲醇在70℃水浴條件下索氏提取5h。提取液用甲醇定容至100mL。 2 結(jié)果與討論 2.1 苦杏仁甙的HPLC分析方法的建立 利用C18作固定相,不同體積比的甲醇和水作流動(dòng)相。當(dāng)甲醇和水的體積比為15∶85時(shí),苦杏仁甙和其他成分基本可以達(dá)到基線(xiàn)分離(見(jiàn)圖2)。苦杏仁甙在215nm波長(zhǎng)下有最大紫外吸收,故紫外檢測(cè)波長(zhǎng)選用215nm。 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):將苦杏仁甙標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇中,并稀釋成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以峰面積對(duì)相應(yīng)的苦杏仁甙濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程為A=1.239 1C+1.772 9,r2=0.998 6,其中A為峰面積,C為質(zhì)量濃度(mg/L)。結(jié)果表明,苦杏仁甙質(zhì)量濃度在1~20mg/L時(shí),其質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋進(jìn)樣,當(dāng)信噪比(S /N)為3時(shí)的濃度即為檢出限。測(cè)得苦杏仁甙的檢出限為0·2mg/L。
精密度實(shí)驗(yàn):取質(zhì)量濃度分別為5,10,15mg/L的苦杏仁甙標(biāo)準(zhǔn)液,分別重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)得峰面積,計(jì)算其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0·71%,0·49%和0·88%,說(shuō)明色譜分析方法具有良好的精密度。 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一份樣品溶液,于室溫下放置,分別在0,2,4,6,8h取樣,在相同色譜條件下測(cè) 定峰面積。苦杏仁甙的峰面積基本保持不變,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0·40%。說(shuō)明被測(cè)組分在本實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定。 加樣回收率:取已知含量的純山楂粉末樣品5份,分別加入0·100 0mg的苦杏仁甙標(biāo)準(zhǔn)品,按樣品測(cè)定方法處理和測(cè)定。計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見(jiàn)表1。由表1數(shù)據(jù)計(jì)算得苦杏仁甙的平均回收率為103·4%,RSD為1·05%。說(shuō)明本方法可靠。
2.2 山楂中苦杏仁甙提取方法的優(yōu)化 苦杏仁甙易溶于甲醇,所以選用甲醇作為提取劑。甄攀等[8]用甲醇從郁李中提取苦杏仁甙并測(cè)定了含量,馬辰等[9]也用甲醇從苦杏仁中提取苦杏仁甙并進(jìn)行了含量測(cè)定。但甲醇能將一些色素和酯類(lèi)大分子同時(shí)提取出來(lái),在分析過(guò)程中污染色譜柱,從而降低柱效,使苦杏仁甙難以和其他物質(zhì)分離。石油醚是一種非極性溶劑,包括色素和酯類(lèi)在內(nèi)的親脂性物質(zhì)易溶于其中,而苦杏仁甙難溶于石油醚。所以首先用石油醚除去這些干擾成分。實(shí)驗(yàn)表明在 石油醚相中檢測(cè)不到苦杏仁甙,說(shuō)明苦杏仁甙幾乎未被石油醚萃取出來(lái)。 索氏提取是中藥有效成分提取的最常用方法,由于它的溶劑是循環(huán)使用的,所以可以更有效地提取中藥的有效成分。選擇70℃的水浴條件是因?yàn)闇囟忍蜁?huì)使溶劑的循環(huán)減慢,而溫度太高則導(dǎo)致苦杏仁甙的分解。圖3是不同提取時(shí)間(2,3,4,5,6和7h)和對(duì)應(yīng)的苦杏仁甙提取量(提取的苦杏仁甙質(zhì)量與原藥材粉末質(zhì)量之比,下文的“苦杏仁甙的含量”也用此表示)的曲線(xiàn),從圖3可以看出5h可以達(dá)到提取平衡。
2.3 不同樣品形態(tài)的山楂中苦杏仁甙的含量 表2列出了含不同量山楂籽的山楂粉末和不同形態(tài)的山楂中苦杏仁甙的含量�？梢钥闯�,隨著山楂籽含量的增加苦杏仁甙的含量也在增加。由此可以推斷出苦杏仁甙在山楂籽中的含量較高。車(chē)?guó)P斌也曾報(bào)道過(guò)苦杏仁甙廣泛存在于杏、桃、李子、蘋(píng)果、山楂等多種薔薇科植物籽和苦扁桃種子中,而且隨著粗粒含量的增加測(cè)得的苦杏仁甙的含量也在增加。由此可以推斷出用山楂粗粒提取苦杏仁甙比用山楂粉提取的量要大。Hwang等曾比較了不同形態(tài)杏仁中提取出的苦杏仁甙的量,也發(fā)現(xiàn)了用粗粒提取時(shí)苦杏仁甙的量比用粉末提取的量要高原因是苦杏仁甙在與之共存的苦杏仁甙酶(emulsin)的作用下水解,山楂粉末的比表面積大,與苦杏仁甙酶接觸充分,促進(jìn)了苦杏仁甙的水解,造成測(cè)得的苦杏仁甙的含量比粗粒山楂低。
3 結(jié)論 本文建立了一種簡(jiǎn)便可行的從山楂中提取并定量測(cè)定苦杏仁甙的方法:先用石油醚超聲提取15min,然后采用索氏提取法用甲醇提取殘?jiān)?h,提取液用HPLC方法(C18柱,15%的甲醇水溶液為流動(dòng)相)檢測(cè)苦杏仁甙含量。本方法可以用作檢測(cè)山楂中苦杏仁甙的質(zhì)量控制方法。從不同樣品的分析結(jié)果可以得出結(jié)論,含山楂籽量大的山楂樣品中苦杏仁甙的含量高,而山楂粗粒中苦杏仁甙的提取量比粉末樣品的提取量高。 |
