惡性黑素瘤是一種起源于黑色素細(xì)胞的高度惡性腫瘤，易轉(zhuǎn)移，病死率高，目前惡性黑素瘤的治療模式提倡采用多學(xué)科的綜合治療，傳統(tǒng)中草藥以其不良反應(yīng)低、安全有效的特點(diǎn)逐漸成為研究的熱點(diǎn)之一。和厚樸酚是中藥厚樸的主要有效成分之一，近年來研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚對(duì)多種惡性腫瘤均有一定的拮抗作用，其抗腫瘤效應(yīng)具有多靶點(diǎn)、多途徑、不良反應(yīng)低的特點(diǎn)，但有關(guān)和厚樸酚對(duì)黑色素瘤細(xì)胞作用的報(bào)道甚少。本研究旨在探討和厚樸酚在體外對(duì)人黑色素瘤 A375細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為其應(yīng)用于惡性黑素瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與方法
1．1 材料：①藥品和試劑：和厚樸酚購自西安天一生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：20080112，純度>99％)；人黑色素瘤A375細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(M，I1t)購自美國Sigma：公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司； Annexin—V—FITC(PI)雙染色試劑盒購自上海美季生物技術(shù)有限公司；和厚樸酚用DMSO溶解，0．221xm尼龍濾膜過濾除菌，母液濃度為lOOm#ml，一20％避光保存，臨用前用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成所需濃度(DMsO 濃度≤0．1％)；②主要儀器：FASCalibur流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品；E1x800酶標(biāo)儀為美國BioTek公司產(chǎn)品；尼康TE2000倒置相差顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。
1．2 方法
1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng)：將A375細(xì)胞置于37℃ 、5％CO2的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10％ 小牛血清、pn值 7．4的RPMI1640。每隔48h換液1次，以l：5的比例傳代。
I．2．2 MqT法檢測細(xì)胞增殖抑制率：取對(duì)數(shù)生長期 A375細(xì)胞，以RPMI1640培養(yǎng)液制成1×10 ／ml細(xì)胞懸液接種于96孔板上，200 孔。培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后吸除原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入200 不同濃度的和厚樸酚(終濃度2．5、5、10、20、40、8O m1)，對(duì)照組加等量不含和厚樸酚的RPMI1640培養(yǎng)液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別將每組細(xì)胞培養(yǎng)24、48 72、96h后，進(jìn)行MTr實(shí)驗(yàn)。每孔加入20 MTr (5mg／m1)，再培養(yǎng)4h后吸去上清液，每孔加 150~1DMSO，振蕩10min，酶標(biāo)儀測492nm吸光度(A) 值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，并繪制濃度、時(shí)間效應(yīng)曲線。細(xì)胞增殖抑制率：(對(duì)照組A值一實(shí)驗(yàn)組A值)／對(duì)照組A值×100％。
1．2．3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：取對(duì)數(shù)生長期A375細(xì)胞，以RPM11640培養(yǎng)液制成l X10 ／ml細(xì)胞懸液接種于6 孔板上，1m1／孔。培養(yǎng)24h后吸除原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入1ml不同濃度和厚樸酚(終濃度5、10、2O~g／ m1)，對(duì)照組加等量不含和厚樸酚的RPMI1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48h，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
1．2．4 流式細(xì)胞儀檢測凋亡率：取對(duì)數(shù)生長期A375 細(xì)胞，以RPMI1640培養(yǎng)液制成1×10。／ml細(xì)胞懸液接種于24孔板上，1ml／~L。培養(yǎng)24h后吸除原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組每孔分別加入1ml不同濃度和厚樸酚(終濃度 5、10、20~g／m1)，對(duì)照組加等量不含和厚樸酚的RP-MI1640培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)48h后，離心收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗滌2次，加結(jié)合緩沖液調(diào)細(xì)胞密度至1x10 ／ml，取100~1—5ml培養(yǎng)管內(nèi)，加人Annexin-V—FITC液5 l和PI液5 ，4℃ 避光反應(yīng) 30min，上機(jī)檢測分析細(xì)胞凋亡率。
1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(元±s)表示，用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。
2 結(jié)果
2．1 和厚樸酚對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響：除2．5i~g／ml 和厚樸酚作用24、48、72h外，其余各點(diǎn)的抑制率與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0．05)，見表1。而且隨著和厚樸酚濃度的增加和作用時(shí)間的延長， A375細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸升高，抑制作用呈現(xiàn)明顯的濃度和時(shí)間依賴性。
2．2 和厚樸酚作用后A375細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：3個(gè)濃度的和厚樸酚(5、10、20txg／m1)作用A375細(xì)胞48h 后，相差顯微鏡下可見細(xì)胞變小，多呈類圓形，胞質(zhì)濃縮，胞質(zhì)中顆粒明顯增多，核固縮和核碎裂，可見凋亡小體，部分細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中；而對(duì)照組細(xì)胞貼壁牢，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞質(zhì)中顆粒很少，未見凋亡小體。
2．3 和厚樸酚對(duì)A375細(xì)胞凋亡率的影響：5、1O、 20txg／ml的和厚樸酚作用A375細(xì)胞48h后，凋亡率分另U為(7．27±1．72)％ 、(9．85±2．31)％、(12．54± 2．93)％ ，對(duì)照組凋亡率為(1．54±0．41)％，3個(gè)濃度組的凋亡率與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P <0．05)，但不同濃度組之問相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0．05)。
3 討論
和厚樸酚是從木蘭科植物厚樸的根皮、枝皮中提取分離的一種帶有烯丙基的連苯二酚類化合物，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗心律失常、抗癲癇等多種生物活性¨ J。隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)和厚樸酚對(duì)白血病、肺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤均具有拮抗作用，其抗腫瘤機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、干擾相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路、抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等多種因素有關(guān)。
目前已有大量體內(nèi)外研究證實(shí)，和厚樸酚可以抑制胃癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞 等多種腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。同時(shí)，對(duì)和厚樸酚的研究還發(fā)現(xiàn)它對(duì)纖維母細(xì)胞和淋巴細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒作用，對(duì)這兩種細(xì)胞的安全劑量可達(dá)到40lxg／mlr 。本研究結(jié)果顯示，小劑量(5~g／m1)的和厚樸酚即對(duì)A375細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)明顯的濃度和時(shí)間依賴性，而且小劑量的和厚樸酚即能使A375細(xì)胞的凋亡率明顯增高，提示和厚樸酚對(duì)A375細(xì)胞增殖和凋亡的影響具有不良反應(yīng)低、安全有效的特點(diǎn)。
細(xì)胞的增殖、凋亡均是細(xì)胞周期依賴性的，細(xì)胞周期的失控是腫瘤發(fā)病中極其重要的環(huán)節(jié)，抑制細(xì)胞周期進(jìn)展是抗腫瘤治療的重要途徑之一。已有研究發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚可通過誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞 、血管平滑肌細(xì)胞阻滯于G，期而抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。
Dikalov等研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚可清除黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)的過氧化物，這些過氧化物是核因子一KB(nuclearfactor kappa gene binding，NF—KB)主要的生理學(xué)刺激物，提示和厚樸酚可阻斷黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)的NF．KB信號(hào)通路。而NF-KB在惡性黑素瘤組織中的處于過度活化狀態(tài)，可通過上調(diào)下游靶基因細(xì)胞周期蛋白D1 (CyclinD1)的表達(dá)，促進(jìn)G ／S期轉(zhuǎn)換而加速細(xì)胞的增殖。由此我們推測，和厚樸酚可能是通過阻斷NF—KB 信號(hào)通路，下調(diào)CyclinD1的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G。期，從而抑制A375細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。
綜上所述，小劑量的和厚樸酚即能有效抑制A375 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，這無疑顯示了它在惡性黑素瘤治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值，但和厚樸酚作用于黑色素瘤細(xì)胞的分子機(jī)制仍有待深入探討。 | 
和厚樸酚對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞增殖和凋亡的影響 
