超聲波輔助法提取山茱萸發(fā)酵產(chǎn)物中的熊果酸 | 超聲波輔助法提取山茱萸發(fā)酵產(chǎn)物中的熊果酸 |
| 發(fā)布時間:2013-12-09 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):2590 |
山茱萸(Cornus officinalis Sieb．et Zucc)屬山茱萸系山茱萸科植物，是一種重要 的野生資源．其果肉味酸、澀，微溫，歸肝腎經(jīng)，有補益肝腎、澀精固脫的功效，是中醫(yī)臨床常 用的傳統(tǒng)抗衰老藥物之一，主要功能成分為環(huán) 烯醚萜類、皂苷、多糖、熊果酸、齊墩果酸、鞣質(zhì)等． 熊果酸(ursolie acid，UA)，是一種弱極性的五環(huán)三萜酸， 分子量為456．68，溶點285～287℃ ，易溶于二 氧六環(huán)、吡啶，可溶于甲醇、乙醇、丁醇，略溶于 丙酮，微溶于苯、氯仿、乙醚，不溶于水和石油醚．研究表明，熊果酸具有較高的生物學(xué)活性， 包括抗癌、對肝損傷的保護、抗菌消炎和抗病毒等作用．熊果酸具有較高的醫(yī)用價值和保健功能，有廣闊的市場前景，所以熊果酸的提取越 來越受到廣大科研學(xué)者的關(guān)注． 山茱萸中熊果酸的提取方法有多種，如索 氏提取法、超聲波提取法、乙醇回流提取法、超 臨界流體萃取法(SFE)等．其中超聲波提取法是利用超聲波強大的空化作用使細(xì)胞壁破碎， 強化傳質(zhì)，能顯著提高熊果酸的提取效率．在原料中加入酵母菌，利用其酵解糖分的特點，分 解山茱萸中的糖類，充分消除影響提取過程及 效率的雜質(zhì)．由于熊果酸屬于萜類，不會因酵母 發(fā)酵而影響得率和性質(zhì)．降低山茱萸中的糖分，不但可以簡化提取工藝，而且還可以提高粗提 物中熊果酸的含量．迄今為止，有關(guān)酵母除糖結(jié)合超聲波輔助提取技術(shù)應(yīng)用于山茱萸中熊果酸 提取尚未有文獻(xiàn)報道． 1 材料與方法 1．1 材料 山茱萸干燥果實產(chǎn)于浙江省臨安市，由杭 州天目生物科技有限公司提供．釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)；熊果酸對照品購于中國藥品生物制品鑒定所；甲醇為國產(chǎn)色譜純，其余均為國 產(chǎn)分析純． 1．2 儀 器 KYC100B型搖床(上海�，攲嶒炘O(shè)備有 限公司)；WYT型糖量計(福建省泉州市萬達(dá)實驗儀器設(shè)備有限公司)；KQ2200DB型數(shù)控 超聲發(fā)生器(江蘇省蘇州市昆山市(縣)超聲儀器有限公司)；島津LC一20A型高效液相色譜儀 (日本島津公司)；DZX一6090真空干燥箱(上海 福瑪實驗設(shè)備有限公司)． 1．3 方 法 1．3．1 山茱萸提取工藝流程 山茱萸漿(山 茱萸干粉+水)一發(fā)酵除糖一加酒精一超聲提取一過濾(棄去濾渣)一濃縮一減 壓干燥一初制品． 1．3．2 材料預(yù)處理 1．3．2．1 山茱萸發(fā)酵．稱取20 g粉碎過的山 茱萸干燥果實，置于三角瓶中，加入40 mL水， 攪勻，沸水浴加熱． 干酵母活化：按設(shè)定條件，稱取一定量干酵 母，加入1O倍質(zhì)量的水，40℃ 加熱15 rain，轉(zhuǎn) 移至3O℃ 的水浴鍋中，待酵母液體冷卻，轉(zhuǎn)入 三角瓶中，用牛皮紙封閉瓶口，置于搖床上，在 設(shè)定條件下發(fā)酵． 1．3．2．2 發(fā)酵液糖分含量測定．每隔12 h用 糖量計測量發(fā)酵液的糖度，記錄發(fā)酵液糖度的 變化． 1．3．2．3 發(fā)酵條件的選擇．本實驗對發(fā)酵溫度、酵母接種量、搖床轉(zhuǎn)速進行單因素探索，分 別考察3個因素對原材料最終糖度和發(fā)酵速度 的影響． 1．3．3 山茱萸中熊果酸提取方法 發(fā)酵完 畢后，發(fā)酵液加入800 mL不同濃度的酒精，置 于超聲發(fā)生器中，控制提取溫度、超聲波功率和提取時間，提取液過濾后定容于1000 mL的容 量瓶中． 1．3．4 提取液中熊果酸含量測定 1．3．4．1 色譜柱條件．色譜柱Hypersil C 8(25 cmX4．6 mm，粒徑5 m)；流動相：甲醇一水一磷 酸(90：10：0．1)；檢測波長215 nm，流速1．2 mL．min_1；柱溫：室溫．熊果酸對照品和山茱萸的HPLC圖譜見圖2，添加回收率為94．2 ． 1．3．4．2 對照品溶液制備．精密稱取干燥至恒重的熊果酸對照品2 mg，用色譜純甲醇溶 解，溶液中熊果酸最終濃度為1 mg．mL，以 微孔膜過濾，置于冰箱內(nèi)冷藏保存，待用． 1．3．4．3 樣品液制備．取1 mL定容后的提取 液，用色譜純甲醇稀釋至10 mL，以微孔膜過 濾，作為供試品溶液． 1．3．5 正交試驗方案設(shè)計 在預(yù)備實驗的 基礎(chǔ)上選取對熊果酸浸提率影響較大的4個因 素進行正交試驗：酒精濃度，超聲波提取溫度，超聲波功率，超聲波提取時間． 1．4 熊果酸得率計算 X==：(A樣×G際XV)÷(A標(biāo)×Ml原材料)×100 ， 式中A樣為初制品峰面積；A標(biāo)為對照品峰面 積；C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度；V為初制品溶解后溶液體積；M原材料為山茱萸干粉質(zhì)量；X 為熊果酸 得率／ ． 1．5 數(shù)據(jù)處理 本實驗數(shù)據(jù)用Origin pro 7．5版處理，實 驗重復(fù)3次． 2 結(jié)果與討論 2．1 發(fā)酵對山茱萸漿糖度的影響 接種酵母于山茱萸漿中，在酵母最適生長 條件下進行發(fā)酵．發(fā)酵前山茱萸漿的糖度為 20 ．由圖3可知，對照組糖度隨發(fā)酵時間變化 不顯著，而接種組的山茱萸漿糖度從第2 d開始變化顯著，到第3 d變化極顯著，第4 d到第 6 d其變化維持在較高水平，隨后變化顯著性 明顯減弱，第8、9兩天相比糖度變化無顯著性， 維持在8 ．可見通過發(fā)酵能明顯降低山茱萸 漿的糖度． 2．2 發(fā)酵條件的選擇 發(fā)酵條件的選擇主要通過考察溫度、接種 量和搖床轉(zhuǎn)速3個因素對發(fā)酵速度(用1／T表 示，T代表發(fā)酵天數(shù))和發(fā)酵液最終糖度2個指標(biāo)的影響來實現(xiàn)．試驗結(jié)果表明，不同發(fā)酵處理 最終糖度均介于7 ～8 之間，變化不明顯． 2．2．1 發(fā)酵溫度的選擇 控制搖床轉(zhuǎn)速150 r．min，接種量3：80，比較搖床溫度在 20、25、30和35℃ 下的發(fā)酵速度． 溫度是影響發(fā)酵的主要因素之一，根據(jù)發(fā) 酵第一定律 ]，在某一溫度范圍內(nèi)，發(fā)酵速度和 溫度成正比，每增加1O℃ ，發(fā)酵速度將增加1 倍．當(dāng)溫度超過酵母生長最適宜溫度時，高溫對 酵母的生長會產(chǎn)生抑制作用．由圖4可知，發(fā)酵 速度隨著搖床溫度上升逐漸提高，到3O℃時達(dá) 到最高，溫度再繼續(xù)升高到35℃ 時，發(fā)酵速率 有所降低．可見當(dāng)搖床溫度設(shè)為3O℃時發(fā)酵溫 度接近酵母生長最適溫度，發(fā)酵速率最快． 2．2．2 接種量的選擇 控制發(fā)酵溫度3O ℃ ，搖床轉(zhuǎn)速150 r．rain，考察酵母接種量對 發(fā)酵時間的影響． 接種量是影響酵母發(fā)酵速度的因素之一． 酵母生長有4個時期，即遲滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定 期和衰老期，其中遲滯期糖分分解速率比較低，穩(wěn)定期最高．而接種量的多少直接影響到酵母 生長遲滯期的長短，接種量越多遲滯期越短，進 入穩(wěn)定期所用時間越短，達(dá)到糖分最大分解速 率所用時間就越短．由圖5可知，發(fā)酵速率隨著 接種量的增加而增加，但是增加的趨勢逐漸減 小，當(dāng)接種量為3：80和4：8O時，發(fā)酵速率差別已經(jīng)不明顯．綜合考慮時間和成本2個因素， 選擇生產(chǎn)用量為3：80． 2．2．3 搖床轉(zhuǎn)速的選擇 控制發(fā)酵溫度3O ℃ ，接種量3：8O，考察搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵時間的 影響． 搖床轉(zhuǎn)速也是影響發(fā)酵的重要因素之一． 搖床搖動對發(fā)酵的有利影響主要有2個方面：其一是通過搖床搖動能夠使發(fā)酵液中氧氣含量升高，有利于酵母代謝，加速糖分降解；其二是 通過搖床搖動能夠使酵母充分與發(fā)酵液混合， 使發(fā)酵更加充分．但并非轉(zhuǎn)速越高發(fā)酵速率越 高，在發(fā)酵液氧氣含量充足和酵母、發(fā)酵液混合充分的條件下，酵母已經(jīng)達(dá)到最適生長狀態(tài)，增 加轉(zhuǎn)速，發(fā)酵速率將不會提高．由圖6可知，發(fā) 酵速率隨著搖床轉(zhuǎn)速增加而增加，但是增加的趨勢趨于平緩．當(dāng)轉(zhuǎn)速從150 r．min 增加到 170 r．min 時，發(fā)酵速率的增加已不明顯．可見，轉(zhuǎn)速控制在150 r．rain 最合適． 2．3 熊果酸提取工藝參數(shù)的確定 2．3．1 正交因素水平表設(shè)計 選擇酒精濃 度(A)、超聲波提取溫度(B)、超聲波功率(C) 和超聲波提取時間(D)4個因素，利用4因素3 水平正交試驗分析上述4種因素對山茱萸中熊 果酸提取效果的影響． 2．3．2 正交試驗結(jié)果 在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計L(3 )正交試驗． 由表可知，超聲提取溫度和超聲功率的 極差值較大，兩因素對熊果酸的提取影響比較大，而酒精濃度和提取時間極差值相對較小，對 熊果酸提取影響不明顯．各因素對熊果酸提取 影響的大小次序為：B(超聲波提取溫度)>C (超聲功率)>A(酒精濃度)>D(超聲波提取 時間)．最佳提取方案為：ABCD，即酒精濃 度85 ，提取溫度50℃ ，超聲功率100 W，超 聲時間30 rain．追加試驗結(jié)果表明，在此條件 下熊果酸的浸出率為0．2512 ． 2．4 熊果酸得率及分析 通過HPLC法測定，計算出在最優(yōu)工藝條 件下熊果酸得率為0．2512 ．該工藝的熊果酸 得率明顯高于其他方法，如索氏提取法提取率 1．82 mg．g [73(得率為0．182 )，超聲波提取法提取率1．84 mg．g (得率為0．184 )，乙 醇回流提取法提取率2．2 mg．g _8 (得率為 0．22 )．該工藝之所以有高的熊果酸得率，主要有2個方面的原因：一是通過發(fā)酵預(yù)處理酵 母代謝掉了原料中大量糖分，有助于熊果酸的溶出；二是合適條件下的超聲波處理使植物細(xì)胞最大程度的破碎，使熊果酸能最大程度的和 提取劑接觸，降低了熊果酸溶出的阻力． 3 結(jié) 論 3．1 山茱萸中熊果酸的最佳提取工藝及熊果酸得率：發(fā)酵參數(shù)為發(fā)酵溫度30℃ ，酵母菌接 種量和原料比值3：80，搖床轉(zhuǎn)速150 r． rain_。，時間5 d．超聲波提取參數(shù)為酒精濃度 85 ，提取溫度50℃ ，超聲功率100 W，提取時 間30 rain．熊果酸得率為0．2512 ． 3．2 酵母發(fā)酵法除糖是利用酵母菌能對糖及 其衍生物降解，在合適的工藝參數(shù)下，該方法能 顯著降低山茱萸的糖度而不影響熊果酸含量． 3．3 超聲波輔助提取法能夠提高提取率的主 要原因是超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)_8j，能有效破 碎細(xì)胞壁，增大細(xì)胞的通透性，強化傳質(zhì)，從而提高提取效率．超聲波法提取熊果酸，在合適的 工藝參數(shù)下提取時間短、提取溫度較低、收率高、快捷、簡便易行． 3．4 超聲波輔助發(fā)酵法提取熊果酸工藝能顯 著提高熊果酸得率，降低提取過程中的處理難度，方法簡便易行，為熊果酸提取提出了新思 路，也為山茱萸綜合利用奠定了基礎(chǔ)． |
