熊果酸體內(nèi)抗肺癌作用機(jī)制探討 | 熊果酸體內(nèi)抗肺癌作用機(jī)制探討 |
| 發(fā)布時(shí)間:2013-12-09 信息來(lái)源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):1625 |
摘 要:目的：探討熊果酸對(duì)人肺癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其機(jī)制。方法：采用人肺腺癌A549細(xì)胞株進(jìn)行裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)。通過(guò)移植瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)、終末瘤重計(jì)算抑制率觀(guān)察熊果酸對(duì)人肺癌裸鼠移植瘤的抑制作用，采用免疫組化法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)、微血管密度，TUNEL檢測(cè)凋亡指數(shù)，探討其作用機(jī)制。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組用藥后移植瘤生長(zhǎng)緩慢，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組瘤重及瘤體積明顯低于對(duì)照組（P〈0．05），抑瘤率為51．35％。實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織微血管密度及VEGF蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P均〈0．01），實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞凋亡指數(shù)高于對(duì)照組（P〈0．01）。結(jié)論：熊果酸對(duì)裸鼠肺腺癌移植瘤生長(zhǎng)有抑制作用，其機(jī)制可能與降低移植瘤促血管生成因子VEGF的表達(dá)、抑制新生血管的形成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。 關(guān)鍵詞:肺腫瘤 細(xì)胞凋亡 血管生成 熊果酸 Ursolic acid inhibits the angiogenesis of transplanted human lung adenocarcinoma cell line A549 in nude mice Abstract:Objective： To study the inhibitory effect of ursolic acid on the transplanted human lung adenocarcinoma cell line A549 in nude mice and explore its mechanism. Methods： The nude mice beating A549 cancer cells were established in vivo. The transplanted tumor growth curve was drawn, and the inhibitive ratio was calculated according to tumor weight. Immunohistochemistry （S-P）was used to examine the expression of VEGF and MVD of the transplanted tumor, and TUNEL （Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated UTP nick end labeling） was used to examine the apoptosis index of the transplanted tumor. Results： The transplanted tumor of the treated group grew slowly. The vol- ume and the weight of tumors in the treated group were smaller than those in the controLgroup. The tumor inhibitive rate was 51.35%. The expressions of VEGF and MVD in the treated group were lower than those of the control group, and the apoptosis index of the transplanted tumor in the treated group was higher than that in the control group （ P 〈 0.01 ）. Conclusion： Ursolic acid has an anti-angiogenesis activity on the human lung adenocarcinoma cell hne A549 in vivo by inducing the apoptosis of the cancer cells, deceasing the VEGF expression and inhibiting the vasoformation of the transplanted tumor Key words:Lung cancer; Apoptosis; Angiogenesis; Ursolic acid 熊果酸(ursolic acid)，又名烏索酸，屬于 香樹(shù) 脂醇型五環(huán)三萜類(lèi)化合物，有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)和藥理活性。近年研究表明，熊果酸不僅對(duì)多種致癌、促癌物質(zhì)有抵抗作用，而且在體外能抑制多種腫瘤 細(xì)胞的生長(zhǎng)⋯ ，并可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)的活 化、增殖、遷移，具有抑制血管形成的作用。本研究探討熊果酸體內(nèi)對(duì)人肺癌裸鼠移植瘤的抑制作 用，通過(guò)檢測(cè)移植瘤細(xì)胞的凋亡、組織中微血管密度 及VEGF蛋白表達(dá)，觀(guān)察其對(duì)瘤組織血管形成和細(xì)胞凋亡的影響，對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。 1 材料與方法 1．1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞株由 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所惠贈(zèng)，培養(yǎng)在含10％小牛 血清、青霉素及鏈霉素各100 U／ml的RPMI．1640培養(yǎng)液中，37 oC、5％co~飽和濕度條件下培養(yǎng)，0．25％ 胰蛋白酶消化傳代。 1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑BALB／C(nu／nu)裸小鼠購(gòu)自 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，l2只，SPF級(jí)，鼠 齡3—4周，體重l7—20 g，雄性，飼養(yǎng)于超凈生物層 流架內(nèi)，環(huán)境定期紫外線(xiàn)消毒，保持恒溫(25±2)"12、恒濕(45％ 一50％)，籠具、飲水均經(jīng)高壓蒸汽滅菌，實(shí)驗(yàn)操作均在無(wú)菌罩內(nèi)進(jìn)行。熊果酸純品購(gòu)自Sig． 眥公司；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Ⅶ GF)鼠單克隆抗體、 cD34鼠單克隆抗體、羊抗鼠、羊抗兔ISC-rIRP、SP試 劑盒、TUNEL試劑盒、DAB均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。 1．3 方法 1．3．1 熊果酸對(duì)裸鼠肺癌移植瘤的抑制作用 將 A549細(xì)胞按常規(guī)方法復(fù)蘇擴(kuò)增，消化后無(wú)血清培養(yǎng) 液離心洗滌2次，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×l 個(gè)， lTll，臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)>99％。用帶6號(hào)針頭 注射器抽取癌細(xì)胞懸液接種于裸鼠右前腋部皮下，每個(gè)部位接種0．2 ml，成瘤后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì) 照組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組給予熊果酸50 mg／(kg·d)溶于0．2 ml生理鹽水，對(duì)照組給生理鹽水0．2 ml／d，均 行腹腔注射，1次，d，連續(xù)治療20 d。實(shí)驗(yàn)中注意觀(guān)察裸鼠精神、進(jìn)食、排便及體重情況。隔天用游標(biāo)卡尺 測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑a和短徑b，按公式V=0．5×a×b2計(jì) 算移植瘤體積，繪制生長(zhǎng)抑制曲線(xiàn)。最后1次用藥 24 h后以脫頸方式處死裸鼠，剝出腫瘤，計(jì)算各組平 均瘤重及抑瘤率(Inhibit Rate，IR)。 IR=((對(duì)照組平均瘤重一給藥組平均瘤重)，對(duì) 照組平均瘤重]×100％。 1．3．2 病理學(xué)檢查 對(duì)裸鼠進(jìn)行解剖，肉眼觀(guān)察重 要臟器及淋巴結(jié)情況，取腫瘤及重要器官組織以 10％福爾馬林固定、石蠟包埋切片，F(xiàn)IE染色，光鏡 下觀(guān)察組織結(jié)構(gòu)變化。 1．3．3 免疫組化法檢測(cè)移植瘤VEGF蛋白表達(dá)和 微血管密度計(jì)數(shù) 免疫組化染色采用鏈霉菌素一生物素(S-P)免疫組化技術(shù)，移植瘤石臘標(biāo)本4 tan切 片2張，常規(guī)脫臘，組織抗原修復(fù)采用微波抗原修復(fù) 法，VEGF和c 一抗工作濃度均為1：50，具體染色 步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將已知的乳腺癌陽(yáng)性 切片作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。 VEGF蛋白的陽(yáng)性表達(dá)為癌細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜內(nèi) 出現(xiàn)棕黃色穎粒。按照B溉tsa1ie 的方法判斷染色 結(jié)果，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度分為4級(jí)，并分別記_分：細(xì)胞無(wú)著色為陰性(0分)；著淺黃色為弱陽(yáng)性(1分)； 著棕黃色為中度陽(yáng)性(2分)；著棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性(3 分)。在每張切片上隨機(jī)選取l0個(gè)視野(10×lO)， 計(jì)數(shù)每一強(qiáng)度視野數(shù)所占的比率(F)，根據(jù)下列公 式計(jì)算每張切片的平均染色強(qiáng)度(intensity sc0 ， IS)。IS= [(0×F0)+(1×F1)十(2×F2)+(3× F3)]，F(xiàn)=10×視野％。 微血管密度(MVD)的判斷以c 標(biāo)記微血管， 計(jì)算瘤內(nèi)著色的毛細(xì)血管和微小血管。按照Wei． dn ]的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，凡呈現(xiàn)棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi) 皮細(xì)胞簇均作為1個(gè)血管計(jì)。低倍鏡下選擇微血管 最密集的3個(gè)視野，在高倍鏡視野范圍內(nèi)，計(jì)數(shù)所有的染色微血管數(shù)，取3個(gè)視野計(jì)數(shù)結(jié)果的均數(shù)為該 切片的微血管數(shù)。 1．3．4 原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法法檢測(cè)移植瘤的細(xì)胞凋亡 移植瘤石蠟切 片常規(guī)脫蠟，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，蘇木 素復(fù)染細(xì)胞核。將已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，以 不含末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶的標(biāo)記液處理的切片作陰性對(duì)照。細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì) 胞，隨機(jī)選lO個(gè)視野，每個(gè)視野觀(guān)察100個(gè)細(xì)胞，計(jì) 數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptotic Index，AI)。 AI(％)=陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀(guān)察細(xì)胞總數(shù)×100％。 1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSSIO．0 for win． dows軟件包，組間差異選用t檢驗(yàn)，以P<0．05為 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2．1 熊果酸抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)及抑瘤率 兩 組裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)組在用藥6 d 后出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制，移植瘤體積增長(zhǎng)緩慢。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，兩組裸鼠的鼠重、瘤重、瘤體積見(jiàn)表1。由表1 可見(jiàn)，兩組裸鼠的體重?zé)o明顯差別，與實(shí)驗(yàn)前比較有增長(zhǎng)但改變不明顯，治療結(jié)束時(shí)治療組移植瘤的瘤 重及體積明顯低于對(duì)照組(P<0．05)，抑瘤率為 51．35％。肉眼觀(guān)察各組裸鼠重要臟器及淋巴結(jié)未見(jiàn)明顯的轉(zhuǎn)移病灶，但對(duì)照組移植瘤均不同程度的侵犯右前肢肌肉組織，且瘤體表面微血管豐富。而實(shí) 驗(yàn)組均無(wú)上述表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組裸鼠心、肝、腎、肺、腦等 組織切片HE染色均未見(jiàn)病理性改變。實(shí)驗(yàn)組裸鼠一般情況均無(wú)明顯變化，未觀(guān)察到藥物相關(guān)性副作 用，如活動(dòng)遲緩、腹瀉、厭食、精神萎靡等癥狀。對(duì)照 組移植瘤HE 染色切片顯示癌細(xì)胞密集，呈團(tuán)塊狀分布，有明顯的異質(zhì)性，核大深染，核仁明顯，胞漿豐 富，可見(jiàn)較多核分裂像與微血管形成，間質(zhì)極少。而 實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞排列較稀疏，呈不同程度的退行性變， 核深染固縮，核漿比例減少，可見(jiàn)大片無(wú)結(jié)構(gòu)的壞死區(qū)，核分裂像與微血管形成較少。
圖1 兩組裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)曲線(xiàn) Fig．1 Growth CUI’W~ oftransplanted tumor in two groups 表1 兩組裸鼠體重及移植瘤瘤重和抑制率(牙±s)
-p<0．05 vs與對(duì)照組 2．2 移植瘤組織內(nèi)的VEGF蛋白表達(dá)和微血管密 度計(jì)數(shù) VEGF陽(yáng)性表達(dá)位于癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)， 呈棕黃色顆粒，細(xì)胞膜也可見(jiàn)弱表達(dá)，c 標(biāo)記血管 內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色，兩組移植瘤組織均有陽(yáng)性表達(dá)，有的形成管腔，有的為單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞 或內(nèi)皮細(xì)胞簇。腫瘤邊緣組織的MVD高于瘤中央。 實(shí)驗(yàn)組VEGF表達(dá)和MVD均明顯低于對(duì)照組(P均 <0．01)，見(jiàn)表2。 表2 移植瘤組織VEGF蛋白表達(dá)和MVD計(jì)數(shù)(牙±s)
-p<0．01 vs對(duì)照組 2．3 移植瘤組織細(xì)胞的凋亡指數(shù)檢測(cè) TUNEL法 檢測(cè)瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)結(jié)果，對(duì)照組AJ為2．3±2．1， 實(shí)驗(yàn)組 為12．3±1．2，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。 3 討論 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，熊果酸以游離形式或與糖結(jié)合 形式分布于大約34個(gè)科46個(gè)屬的108種植物中。 熊果酸具有廣泛的生物效應(yīng)，體外實(shí)驗(yàn)表明，熊果酸 具有多種抗腫瘤活性b J。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)人肺癌A549 細(xì)胞裸鼠移植瘤，觀(guān)察熊果酸的體內(nèi)抗肺癌作用，結(jié) 果顯示，用藥后實(shí)驗(yàn)組移植瘤生長(zhǎng)速度明顯低于對(duì)照組，治療結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組瘤重及瘤體積明顯低于對(duì) 照組(P<0．05)，抑瘤率為51．35％。表明熊果酸可 以抑制肺癌移植瘤的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組裸 鼠心、肝、腎、肺、腦組織HE 染色切片顯示組織結(jié)構(gòu) 正常，未見(jiàn)異常病灶，而實(shí)驗(yàn)組裸鼠也未發(fā)現(xiàn)其它藥 物相關(guān)不良反應(yīng)，表明其抗肺癌作用時(shí)對(duì)機(jī)體無(wú)明 顯的毒副作用。 為進(jìn)一步探討熊果酸抗肺癌機(jī)制，我們檢測(cè)了 兩組移植瘤組織內(nèi)的VEGF蛋白表達(dá)和微血管密度 計(jì)數(shù)以及癌細(xì)胞的凋亡指數(shù)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組 VEGF表達(dá)和MVD均明顯低于對(duì)照組(P <0．01)。 實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織AI為l2．3±1．2，對(duì)照組AI僅為 2．3±2．1，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．01)。 表明熊果酸可以抑制移植瘤組織的血管形成，誘導(dǎo) 腫瘤細(xì)胞凋亡。 腫瘤組織的新生血管形成在腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn) 和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。在腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程 中，因微環(huán)境改變(缺氧、pH值下降、NO升高)、突變型p53、ms等基因上調(diào)VEGF等血管生成因子以及腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞雙向旁分泌作用(相互釋放促 生長(zhǎng)因子)，則啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞的血管生成開(kāi)關(guān)，激活血管生成因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，形成血管 芽及微血管，同時(shí)也激活基質(zhì)金屬蛋白酶活性，使細(xì) 胞外基質(zhì)降解，利于血管形成、延伸及腫瘤生長(zhǎng)、浸 潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。而VEGF是目前所知最強(qiáng)的、直接作用 于血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成促進(jìn)因子。Sohn等以 雞胚胎絨毛膜實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行研究，結(jié)果顯示，熊果酸 具有較強(qiáng)的血管生成抑制作用，并有劑量依賴(lài)性。 本研究結(jié)果顯示，熊果酸明顯降低移植瘤的VEGF 表達(dá)和微血管密度，表明它可以在體內(nèi)抑制肺癌血 管生成，從而抑制肺癌增殖，證明熊果酸是有效的肺 癌血管抑制劑，而其抑制血管生成的機(jī)制與下調(diào)移植瘤VEGF表達(dá)有關(guān)�？寡苌煽赡苁切芄峥� 肺癌的機(jī)制之一。 細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的一種主動(dòng)性細(xì)胞自殺 過(guò)程，具有獨(dú)特的生化和形態(tài)特征。對(duì)腫瘤生長(zhǎng)起著負(fù)調(diào)控作用，是抗腫瘤的重要途徑。Kim等 的 研究顯示，熊果酸使p21WAFI表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞 色素c釋放和caspase．3激活，抑制DNA復(fù)制，從而 導(dǎo)致肝癌HepG2細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期終止。Hammand 等在對(duì)HaCat細(xì)胞的研究中也得到同樣的結(jié) 論，推測(cè)熊果酸誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯可能是由 p21WAH起作用，同時(shí)使392位的絲氨酸磷酸化易 位到核內(nèi)，使p53獲得抗腫瘤活性。我們運(yùn)用 TUNEL法檢測(cè)移植瘤組織的凋亡指數(shù)，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組移植瘤組織中癌細(xì)胞凋亡率顯著增加，提示 熊果酸在體內(nèi)具有誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用。以此 我們可以認(rèn)為，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡也是熊果酸體內(nèi)抑制 肺癌生長(zhǎng)的機(jī)制之一。 |
