虎杖提取物白藜蘆醇對AMI后心臟血管新生及冠脈側(cè)支循環(huán)影響的實(shí)驗(yàn)研究 | 虎杖提取物白藜蘆醇對AMI后心臟血管新生及冠脈側(cè)支循環(huán)影響的實(shí)驗(yàn)研究 |
| 發(fā)布時(shí)間:2013-12-10 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):2494 |
白藜蘆醇是存在于葡萄皮、花生及中藥虎杖等植物中一種非黃酮類多酚化合物，既往研究顯示其可減輕急性心肌梗死(AMI)后缺血一再灌注損傷.。2009年5月，我們觀察了白藜蘆醇對AMI后血管新生、冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的影響，旨在進(jìn)一步探討其保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用機(jī)制。 1 材料與方法 1．1 材料新西蘭大耳白兔(雌雄不拘)32只，體質(zhì)量(2 500 550)g，由徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供；白藜蘆醇，長效消心痛；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體，促血管生成素．1(Ang一1)抗體，CD 抗體。 1．2 動(dòng)物分組及處理將32只兔隨機(jī)分為四組各 8只，B、C、D三組均參考蔣清安等 的方法并加以改進(jìn)建立AMI模型，具體方法：32只兔稱重后按照 4 ml／kg予10％水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺，用手術(shù)剪沿胸骨正中打開胸腔3～4 cm，充分暴露術(shù)野，于左房下緣下1—2 cm處用5／0 無創(chuàng)傷縫合線結(jié)扎與心大靜脈伴行的左前降支，觀察心肌顏色變化，同時(shí)描記心電圖，心肌由鮮紅色變?yōu)榘导t色、sT段弓背向上抬高>0．5 mV時(shí)表明 AMI模型制作成功；A組為假手術(shù)組，除不結(jié)扎左前降支外余步驟同上。各組均于術(shù)后24 h行下列處理：A、B組予生理鹽水3 ml灌胃1次／d，C組予長效消心痛2．4 mg／kg+3 ml生理鹽水灌胃1 次／d，D組予白藜蘆醇3 mg／kg+生理鹽水3 ml灌胃1次／d。各組均持續(xù)給藥15 d后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，留取心肌標(biāo)本，于一80 保存或4％福爾馬林固定后制作石蠟切塊。 1．3 相關(guān)指標(biāo)檢測①梗死面積：將各組心肌組織石蠟切片(厚度4 m)經(jīng)HE染色，顯微光鏡10× 視野下觀察心肌壞死情況，采集圖像，用Image pro plus 6．0圖像分析系統(tǒng)測量切片上心外膜表面瘢痕區(qū)弧長，同時(shí)測量整個(gè)心臟外膜弧長，每個(gè)切面心肌梗死面積=疤痕區(qū)弧長／心臟外膜弧長×100％。② 梗死邊緣區(qū)微血管密度(MVD)：按文獻(xiàn) 將梗死心肌周邊2 InlTl范圍界定為梗死邊緣區(qū)。微血管判定-4 J：以CD 標(biāo)記血管內(nèi)皮，凡是染成棕黃色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，凡管腔>8個(gè)紅細(xì)胞大小、帶有較厚肌層的血管區(qū)域血管均不計(jì)數(shù)。顯微鏡400×視野下，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)梗死邊緣區(qū)新生血管數(shù) (MVC)，取其平均值，每視野下MVC即為MVD。③ 梗死邊緣區(qū)VEGF及Ang一1蛋白表達(dá)：分別采用免疫組化法及Western blot法檢測。取梗死邊緣區(qū)心肌組織石蠟切片、常規(guī)脫蠟至水并行免疫組化染色，應(yīng)用顯微鏡在相同光源強(qiáng)度下于400×視野每張切片隨機(jī)選取梗死邊緣區(qū)5個(gè)視野的圖像，通過Image pro plus圖像分析軟件檢測其平均光密度值(OD)，將一8O℃凍存組織裂解，標(biāo)定總蛋白濃度后按常規(guī) Western blot方法行凝膠電泳一轉(zhuǎn)膜一封閉一加一抗、一4℃過夜一加二抗一顯色，結(jié)果條帶進(jìn)行灰度值分析。 1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以用x±s表示，分別行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析(ANO．VA)，P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2．1 一般情況32只兔中成功制備AMI模型并存活至治療結(jié)束27只，總存活率為84．4％。共有5 只于術(shù)中、術(shù)后死亡，原因分別為氣胸、感染、心衰、惡病質(zhì)等。 2．2 兩組相關(guān)指標(biāo)測定梗死面積、MVD及梗死邊緣區(qū)VEGF及Ang一1蛋白表達(dá)見表1，Western blot法所測VEGF及Ang一1蛋白表達(dá)見圖1 3 討論 研究顯示，白藜蘆醇可通過抗氧化、清除氧自由基、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)血脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化及促進(jìn)冠脈舒張、增加機(jī)體耐缺氧儲備等發(fā)揮心血管保護(hù)作用_3 J。冠脈側(cè)支循環(huán)建立包括原有側(cè)支開放和新側(cè)支形成，其能減輕心肌缺血壞死、預(yù)防和延緩缺血性心臟病和室壁瘤形成、改善臨床癥狀和預(yù)后。AMI后冠脈原有側(cè)支開放的程度有限，不足以代償機(jī)體的需要；而血管新生促側(cè)支循環(huán)形成則具有重要意義。大量研究表明，多種血管生長因子包括VEGF、成纖維細(xì)胞生長因子、Ang一1、轉(zhuǎn)化生長因子一、肝細(xì)胞生長因子、血小板源性生長因子、黏附分子一I等，均參與心肌缺血缺氧環(huán)境下誘發(fā)的血管新生過程，其中VEGF是已知促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管管腔形成最強(qiáng)有力的生長因子，與新生血管的形成關(guān)系密切；而Ang一1主要由血管平滑肌細(xì)胞和血管周圍細(xì)胞分泌，與其受體Tie-2結(jié)合后具有不依賴于VEGF而對血管生成后期血管內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定和新生血管成熟起調(diào)節(jié)作用的特性l4 J，進(jìn)而有利于形成有效的側(cè)支循環(huán)。 “治療性血管再生”指通過人為增加心肌局部血管生長因子濃度刺激心肌缺血區(qū)新生血管及側(cè)支循環(huán)形成，以達(dá)到改善心肌缺血的目的，即心肌缺血區(qū)的“自我血管搭橋”。目前所用方法主要包括通過體內(nèi)、體外途徑給予外源性生長因子及轉(zhuǎn)基因治療等。由于生長因子體內(nèi)半衰期短、價(jià)格昂貴及轉(zhuǎn)基因治療安全性等問題，應(yīng)用藥物促進(jìn)血管新生的療法正逐步引起重視。以往研究表明，硝酸脂類藥物對側(cè)支循環(huán)開放及新生血管形成 具有一定作用。本研究顯示，C組和D組心肌梗死面積明顯小于B組，梗死邊緣區(qū)MVD及VEGF、Ang一1蛋白表達(dá)顯著高于B組；C 組梗死邊緣區(qū)Ang一1蛋白表達(dá)顯著低于D組。提示 白藜蘆醇和長效消心痛均可促進(jìn)AMI后新生血管及側(cè)支循環(huán)形成，前者促進(jìn)血管新生的機(jī)理可能與其誘導(dǎo)缺血心肌上調(diào)VEGF、Ang一1表達(dá)有關(guān)；后者作為機(jī)體內(nèi)NO的直接供給體可能發(fā)揮了不同于白藜蘆醇 的促血管生成作用。筆者認(rèn)為，有待行新生血管功能測定以進(jìn)一步評估側(cè)支循環(huán)有效性及深入探討白藜蘆醇與消心痛不同的作用機(jī)制；既往有文獻(xiàn)報(bào)道大劑量白藜蘆醇對腫瘤血管生成有抑制作用，本實(shí)驗(yàn)僅行小劑量口服給藥實(shí)驗(yàn)，故白藜蘆醇適宜的給藥劑量及途徑亦有待進(jìn)一步研究。 綜上所述，白藜蘆醇可促進(jìn)AMI后心臟血管新生及冠脈側(cè)支循環(huán)形成，可作為不能耐受硝酸酯類藥物且不適于介入、外科搭橋術(shù)冠心病患者的替代藥物。
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