白藜蘆醇對白血病小鼠抗腫瘤免疫學的初步實驗研究 | 白藜蘆醇對白血病小鼠抗腫瘤免疫學的初步實驗研究 |
| 發(fā)布時間:2013-12-10 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點擊次數(shù):1450 |
白血病是一種常見的造血組織惡性疾病，起源 于造血干細胞的基因突變。由于白血病細胞在髓腔內(nèi)迅速增殖，抑制了正常造血，導致三系血細胞異 常。雖然白藜蘆醇的抗腫瘤作用已經(jīng)在諸多細胞系 中得到證實，但是具體應用劑量在不同的研究中存 在較大差異。鑒于白藜蘆醇的抗腫瘤研究主要在體 外進行，而它必須通過體內(nèi)代謝活化或機體反應才能發(fā)揮作用，因此，體外的藥效結(jié)果在體內(nèi)不一定都 能相對應。闡明白藜蘆醇免疫調(diào)節(jié)作用的具體分子 機制，是對其開發(fā)利用及理論研究的重要前提之一。 本課題選擇白血病腹水瘤小鼠作為研究對象，初步 探討白藜蘆醇對白血病機體免疫功能的影響及其作 用機制。 1 材料和方法 1．1 材料白藜蘆醇(純度98．36％)，MTr購于Sigma公司，RPMI 1640、胎牛血清(FCS)購于Gibco公司，抗鼠CD3一 PE—cy5、CD4一FITC、CD8一PlE購于Ebioseienee公 司，小鼠淋巴細胞白血病細胞株(L1210)由西安交通 大學生命學院王一理老師惠贈。Balb／c小鼠，6周 齡，雄性，體重(20±2)g，西安交通大學醫(yī)學院實驗 動物中心提供(動物合格證：sYxK(陜)2007—003) 1．2 方法 1．2．1 動物的分組及模型建立 Balb／c小鼠隨 機分為6組，每組10只。具體分組如下：陰性對照 組(腹腔內(nèi)注射生理鹽水)，左旋咪唑陽性對照組， L1210組(荷瘤組)，L1210+白藜蘆醇高劑量組， L1210+白藜蘆醇中劑量組，L1210+白藜蘆醇低劑 量組。結(jié)合白藜蘆醇藥理學特點，參照小鼠口服 用量，將白藜蘆醇的用藥濃度定為高劑量50 mg／ (kg·d)，中劑量25 mg／( ·d)，低劑量l2．5 nag／ (kg·d)。均每日清晨8時灌胃，每次0．2 ml，連續(xù)灌 服三周。陽性對照為腫瘤接種第二天起，腹腔注 射左旋咪唑2．5 mg／(kg·d)，連續(xù)10 d為一療 程l 。連續(xù)給藥5 d后，腹腔接種L1210細胞(1× lO6 5 X 106個／m1)，0．2 ml／只。接種后繼續(xù)給藥 16 d。瘤種接種按《全國抗腫瘤藥物體內(nèi)篩選規(guī) 程》的方法進行 2。腫瘤接種后第3天起，每日眼 眶靜脈叢采血進行外周血白細胞計數(shù)及血涂片， 瑞一吉染色找白血病細胞，證實小鼠發(fā)病，模型建 立成功。 1．2．2 白血病小鼠T淋巴細胞功能測定無菌取 脾，制備淋巴細胞，可作為T淋巴細胞懸液，用含 10％胎牛血清RPMI 1 640培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度2× 106／ml ，加入96孔培養(yǎng)板，設三復孔(前三孔為對照 孔，后三孑L為實驗孔，加含10 t,e,／ml Con A的細胞培 養(yǎng)基)，37℃，5％ co2培養(yǎng)72 h，棄上清，加5 mg／ml mT，繼續(xù)培養(yǎng)4—6 h，加人DMSO混勻，570 nln波 長測定OD值，結(jié)果用刺激指數(shù)(SI)表示。SI=實驗 孔OD值 照孔OD值。 1．2．3 白血病小鼠B淋巴細胞功能測定L3J 取B 細胞，與LPS(10 t~g／mi)在37oC，5％co2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)7 d，吸去上清，取細胞懸液涂片，冷丙酮固定10 min，滴加FITC一標記的抗鼠Ig抗體，室溫，避光孵 育60 min，熒光顯微鏡觀察，計數(shù)陽性細胞百分率。 1．2．4 白血病小鼠NK細胞殺傷活性檢測 將靶 細胞(YAC一1細胞)用含10％胎牛血清的RPMI 1 640培養(yǎng)基調(diào)至1 X 105／ml，分離小鼠脾細胞，調(diào)細胞 濃度至1×106／mi，作為NK細胞的來源。取96孔細 胞培養(yǎng)板，對照組分別加靶細胞、效應細胞，再加完 全RPMI 1 640培養(yǎng)基；實驗組為效應細胞+靶細胞 (效：靶為10：1)，37~C，5％ coz培養(yǎng)4 h，加5 mg／na MTr溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO于570珊處測 定OD值。結(jié)果判定：NK細胞殺傷活性(％)=[ODr 一(ODs—ODE)]／(OOr)X 100％ (注：ODT為靶細胞的OD值，ODs為檢測細胞的 OD值，ODE為效應細胞的OD值) 1．2．5 流式細胞術(shù)檢測小鼠T細胞亞群純化T 淋巴細胞與CD3一PE—Cy5、CD4一FITC以及CD8一 PE共同孵育15 min，離心各組樣品，棄上清，加入 500 固定劑，用Beeton Dikinson公司FACSCalibur 型流式細胞儀上機分析cD4 ／cD8 T淋巴細胞亞群。 1．3 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)均用SPSS13．0統(tǒng)計軟 件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析 (one way ANOVA)，方差不齊組經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后再行方 差分析。兩樣本間比較以Bonferroni t檢驗。 2 結(jié) 果 2．1 白藜蘆醇對白血病小鼠存活時間的影響 白藜蘆醇能明顯改善荷瘤小鼠的生存狀態(tài)、延長 白血病小鼠的存活時間，同時明顯減輕小鼠肝脾 組織中白血病細胞的浸潤程度及外周白細胞數(shù) (數(shù)據(jù)未顯示)。根據(jù)Kaplan—Meier曲線評價白藜 蘆醇在體內(nèi)對白血病小鼠存活時間的影響。如圖 1所示，灌服白藜蘆醇后，荷瘤鼠的生存期延長， 中、高劑量組的存活時間明顯長于荷瘤對照組(P <0．01)，低劑量白藜蘆醇組與對照組相比差異無 統(tǒng)計學意義(P>0．05)。 2．2 白藜蘆醇對白血病小鼠T淋巴細胞增殖的影響 T淋巴細胞經(jīng)Con A刺激后的增殖反應：與正 常對照相比，荷瘤對照組小鼠sI顯著降低，而白藜 蘆醇處理組小鼠T淋巴細胞對Con A刺激的增殖反 應明顯增強，且呈劑量依賴性 2．3 白藜蘆醇影響白血病小鼠B淋巴細胞內(nèi)Ig的 產(chǎn)生能力 荷瘤組小鼠抗體產(chǎn)生細胞數(shù)明顯少于正 常組，不同劑量白藜蘆醇干預后，荷瘤小鼠B淋巴 細胞的抗體產(chǎn)生能力得到不同程度的增強，呈一定的劑量依賴性，與荷瘤對照組相比，有顯著性差異)。 2．4 白藜蘆醇增強白血病小鼠NK細胞殺傷活性 荷瘤組小鼠NK細胞殺傷活性減弱，與荷瘤對照 組相比，白藜蘆醇能明顯增強白血病腹水瘤小鼠的 NK細胞殺傷活性，且該作用呈劑量依賴性(表1)。 2．5 白藜蘆醇增加白血病小鼠CD4／CD8比例 25 mg／kg和50 mg／kg劑量組的白藜蘆醇能明顯增加白 血病荷瘤小鼠CIM／CD8比例，與荷瘤對照組比較有 明顯差異。而12．5 mg／kg白藜蘆醇組與荷瘤對照 組相比，差異沒有顯著性。 上述各指標的檢測中，陽性對照組與高劑量組 相比無顯著性差異(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，本研究同 期設置了三組正常對照鼠分別給予相應劑量的白藜蘆醇，觀察其對正常小鼠是否有不良影響。結(jié)果可見三組正常對照小鼠接受白藜蘆醇處理后未發(fā)現(xiàn)有 何不良反應(數(shù)據(jù)未顯示)。 3 討 論 白血病的常用治療方法為化學治療，但是化療 藥物對腫瘤細胞缺乏特異性的選擇作用，在殺傷腫 瘤細胞的同時，往往也殺傷正常細胞，給機體的正常 組織器官，特別是骨髓和消化道造成功能性或器質(zhì) 性的損傷。此外，白血病細胞對化療藥物的耐受性 也是化療失敗的主要原因之一。白藜蘆醇是一種 活性多酚物質(zhì)，富含于多種中藥材植物中，具有抗腫 瘤、抗炎、肝臟保護、免疫調(diào)節(jié)等作用，特別是對造血 系統(tǒng)毒性小的特征，使人們推測它在白血病的治療 中具有潛在的應用價值。為了進一步明確白藜蘆 醇在體內(nèi)是否也具有延緩、抑制或者逆轉(zhuǎn)白血病進 程的作用，本課題采用移植性腫瘤小鼠模型加以驗 證。由于荷實體瘤小鼠的存活時間較腹水型長3個 月左右，影響生存期的因素較多，所以本課題選擇 L1210小鼠白血病細胞建立腹水型腫瘤模型，探討白藜蘆醇抗白血病作用的分子免疫學機制。 本研究觀察到，白藜蘆醇通過增加荷瘤小鼠 cD4 ／CD8 比率、Con A誘導的T淋巴細胞增殖、NK 細胞殺傷活性以及B淋巴細胞內(nèi)Ig產(chǎn)生能力，發(fā)揮 抗白血病作用，且該效應呈劑量依賴性。這些實驗 結(jié)果說明，白藜蘆醇對白血病小鼠具有免疫增強效 應，并且能明顯改善白血病機體的免疫低下狀態(tài)。除了免疫刺激作用外，白藜蘆醇使白血病小鼠B淋 巴細胞k產(chǎn)生能力增強的原因可能與其誘導造血 細胞生成、促進淋巴細胞增殖有關。需要注意的是， 雖然本研究結(jié)果顯示自藜蘆醇能提高T淋巴細胞增殖，但是由于T淋巴細胞的活化增殖是一個極其復 雜的動態(tài)過程，受多種調(diào)控因素的影響，因此，白藜 蘆醇對T淋巴細胞的作用機制還有待于進一步深入 研究闡明。本研究中，白藜蘆醇體內(nèi)抗腫瘤免疫作 用的量效關系呈線性模式，與Feng等l6』的研究結(jié)果 相一致。然而與此矛盾的是，有報道稱白藜蘆醇能 抑制NK細胞的細胞毒作用，或者減少T淋巴細 胞數(shù)量。這些相互矛盾的研究結(jié)果，或許由于采用的實驗體系不同造成的。 值得一提的是，研究人員還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇的免 疫調(diào)節(jié)作用具有雙相性：即不同的研究條件可導致 白藜蘆醇從無作用到免疫增強或者免疫抑制。這種 雙向調(diào)節(jié)效應可能對于清除宿主突變細胞、控制過度活化的免疫應答以及抗移植排斥反應等方面具有深遠的應用價值。 本研究從免疫學角度探討了白藜蘆醇的抗白血 病作用，結(jié)果表明，白藜蘆醇能明顯改善荷瘤小鼠的 生存狀態(tài)、延長白血病小鼠的存活時間，并且通過增 強荷瘤機體的細胞、體液免疫功能，改善白血病小鼠 的免疫低下狀態(tài)，發(fā)揮抗白血病作用。 |
