999国内精品视频免费_国产真人作爱免费视頻_口口亚洲国产综合Av_99Re国产精品视频

 白藜蘆醇(resveratro1)是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的 非黃酮類多酚化合物。化學(xué)名稱為3，4，5一三羥基 一1，2一二苯乙烯。是植物在受到真菌感染、紫外 照射或病理狀況下產(chǎn)生的一種植物補(bǔ)體。它主要存 在于虎杖、葡萄、花生、桑椹、松樹等70多種植物中， 在葡萄中的含量尤為豐富l1j。早期研究表明白藜蘆 醇具有抗炎、抗菌、抗氧化、抑制血小板聚集、降血 脂、保肝、鎮(zhèn)咳、平喘、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生物學(xué)活 性。近年來，隨著對白藜蘆醇研究的深入，發(fā)現(xiàn)白白藜蘆醇具有抗腫瘤的功效，且表現(xiàn)為對腫瘤的起始、 促進(jìn)和進(jìn)展3個(gè)階段均有抑制作用 J。我們對白藜蘆醇對人舌癌細(xì)胞系Tca體外的作用進(jìn)行研究。

 1 材料與方法

 1．1 材料

 舌癌細(xì)胞系Tca(上海細(xì)胞所，本實(shí)驗(yàn)室凍存)； 胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；H — DMEM培養(yǎng)基(Gibicol公司)；胰蛋白酶、MTI’(華 美公司)；DMSO(Sigma公司，美國)。白藜蘆醇(Sig． ma公司，純度大于99．5％)。

 白藜蘆醇的配制：白藜蘆醇由二甲基亞砜 (DMSO)助溶，分裝，一20qC避光保存?zhèn)溆�。用時(shí)用 H—DMEM培養(yǎng)液稀釋，DMSO控制在體積分?jǐn)?shù)小于 0．1％(該體積分?jǐn)?shù)的DMSO對細(xì)胞沒有影響)。

 1．2 方法

 1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng)人舌癌細(xì)胞Tca在5％ C02、37 ℃條件下，用含10％胎牛血清、100 U／mL青霉素、 100~g／mL鏈霉素的H—DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至70％ 80％融合時(shí)，用0．25％胰酶消化傳代繼 續(xù)培養(yǎng)。

 1．2．2 MTI"法測定含白藜蘆醇對舌癌細(xì)胞的生長 抑制將對數(shù)生長期的Tca細(xì)胞胰酶消化，制成單 細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×lO4／：fL接種于96孔 板，5％ C02、37 oC條件下培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組分別 加入0、25、50、100、200和400 ttmol／L(最終濃度)的 白藜蘆醇，對照組加入相同體積的DMSO，每組均設(shè) 置3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)48、72 h后加MTF液(5 mg／ mL)20 L／孔，孵育4 h。加DMSO 150 L／孔，振蕩 5 min，顯色。用酶標(biāo)儀在波長490 nln下讀取吸光 度，計(jì)算細(xì)胞生存率l_3 J。細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)組吸光 度平均值／對照組吸光度平均值)×100％。

 1．2．3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)根據(jù)MTF結(jié)果，白藜 蘆醇組選擇含有75 tanol／L(最終濃度)的H—DMEM 培養(yǎng)液，對照組細(xì)胞用含有相同體積DMSO的H— DMEM培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期的Tca細(xì)胞，用 0．25％胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，用含 10％胎牛血清的H—DMEM培養(yǎng)液把細(xì)胞重懸，細(xì) 胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，以150個(gè)細(xì)胞／皿接種于直 徑為60 mm的培養(yǎng)皿，每組接種3個(gè)平皿。24 h后， 將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含有75 pmol／L白藜蘆醇(最終濃度)的H—DMEM培養(yǎng)液；對照組更換為 含有相同體積DMSO的H—DMEM培養(yǎng)液，37℃、 5％C02飽和濕度環(huán)境下，靜止培養(yǎng)21 d后，棄去培 養(yǎng)液，用PBS(0．01 mol／L，pH7．4)浸洗2次，加入純 甲醇5 ml于室溫下固定15 min，棄去固定液，加入2 rTll姬姆薩應(yīng)用液染色20 min。自來水緩慢洗去染 液，空氣中干燥，將培養(yǎng)皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的 透明膠片，用肉眼計(jì)細(xì)胞克隆數(shù)�？寺⌒纬陕�=克 隆數(shù)／150×100％。

 1．2．4 細(xì)胞周期檢測根據(jù)MTI"結(jié)果，白藜蘆醇組選擇含有100 ta’nol／L(最終濃度)的H—DMEM培 養(yǎng)液，對照組細(xì)胞用含有相同體積DMSO的H— DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)時(shí)間為48 h。用0．25％胰蛋白 酶消化細(xì)胞，1 000 rpm離心5 min，收集細(xì)胞沉淀(注 意：將培養(yǎng)液中懸浮的細(xì)胞一同收集)，PBS洗滌，離 心，將細(xì)胞沉淀用75％乙醇重懸，流式細(xì)胞儀檢測 細(xì)胞周期，相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

 1．2．5 細(xì)胞凋亡檢測根據(jù)MTF結(jié)果，白藜蘆醇組選擇含有100／nnol／L(最終濃度)的H—DMEM培 養(yǎng)液，對照組細(xì)胞用含有相同體積DMSO的H— DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，胰酶消化，收集細(xì) 胞沉淀。按照Annexin V／PI雙標(biāo)試劑盒說明，用雙 蒸水1：4稀釋結(jié)合緩沖液，PBS洗滌樣品細(xì)胞后，以稀釋的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度為2 ×1 055×105／mL。取195 ttL細(xì)胞懸液，加入5 Armexin V混勻，室溫反應(yīng)10 min，PBS洗滌細(xì)胞一 次，再以190 gL稀釋的結(jié)合緩沖液重懸，加lO血 (20／zg／mL)PI，用流式細(xì)胞儀分析。每樣本收集1× 104個(gè)細(xì)胞熒光信號，采用Cellquest軟件分析結(jié)果。

 將Tca細(xì)胞接種24孔板，每孔105個(gè)細(xì)胞，分別 用含有100 tmaol／L(最終濃度)白藜蘆醇和相同體積 DMSO的H—DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h，而后用 Hoechst33258熒光染料染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì) 胞核形態(tài)。

 1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

 所得數(shù)據(jù)采用SPSS8．0統(tǒng)計(jì)軟件行成組t檢 驗(yàn)，P<0．05為顯著性差異。

 2 結(jié)果

 2．1 MTF實(shí)驗(yàn)

 用終濃度分別為0、25、50、100、200和400 umol／ L的白藜蘆醇培養(yǎng)細(xì)胞48、72 h后，隨著藥物濃度的 增加，白藜蘆醇對細(xì)胞生長的抑制作用逐漸增強(qiáng)，顯 示白藜蘆醇對細(xì)胞的抑制作用呈明顯的劑量一時(shí)間 依賴關(guān)系。利用作圖法測得加藥48、72 h后白藜蘆 醇對Tea細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC5o)分別約為100 t~mol／L和75 t~mol／L。(圖1)

 2．2 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

 分別用含有75 tm~ol／L白藜蘆醇(最終濃度)的 H—DMEM培養(yǎng)液和含有相同體積DMSO的H— DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，21 d后，加藥組細(xì)胞的克隆 形成率明顯低于對照組(圖2，P<0．05)。

 2．3 細(xì)胞周期檢測

 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，加藥組相當(dāng)于對照 組而言，G1期細(xì)胞明顯增多(圖3，P<0．05)。

 2 ． 4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

 凋亡早期， 細(xì)胞內(nèi)膜的磷脂酰絲氨酸移位到細(xì) 胞外膜， 熒光標(biāo)記的A r m e x i n V 極易與細(xì)胞外膜的磷 脂酰絲氨酸結(jié)合從而使其染色。T c a 細(xì)胞經(jīng)10 0 > m o l ／L 白藜蘆醇處理4 8 h 后， 細(xì)胞凋亡率高于對照 組( n = 3 ， P < 0 ． 0 5 ) ， 其中加藥組細(xì)胞凋亡率為 ( 8 0 ． 3 ± 5 ． 3 ) ％ ；對照組為( 14 ． 1 ± 2 ． 6 ) ％ 。

 經(jīng)H o e e h s t 3 3 2 5 8 熒光染料染色， 熒光顯微鏡下， 正常細(xì)胞染色質(zhì)均勻、核形態(tài)規(guī)則。10 0 tm l o l ／L 白藜蘆醇作用4 8 h 后， 可見凋亡細(xì)胞，呈現(xiàn)細(xì)胞體積縮小、 核固縮、染色質(zhì)凝集、碎裂等典型的凋亡特征( 圖4 ) 。

 3 討論

 19 9 7 年， J a n g 等l_2 J 較系統(tǒng)地報(bào)道了白藜蘆醇的抗 腫瘤作用后使其受到了人們的廣泛關(guān)注�，F(xiàn)有的文 獻(xiàn)表明白藜蘆醇可拮抗消化、血液、呼吸、生殖等多個(gè)系統(tǒng)來源的多種腫瘤細(xì)胞的增殖， 對腫瘤細(xì)胞的 發(fā)生、促進(jìn)、發(fā)展3 個(gè)階段均有抑制作用。

 M 1 Tr 法檢測藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用具有簡 便、快速、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)， 現(xiàn)已廣泛應(yīng)用 于抗癌藥物的臨床前研究中。本實(shí)驗(yàn)M T I ’ 法顯示 隨著藥物濃度的增加和藥物作用的時(shí)間延長， 其對 細(xì)胞的抑制作用也逐漸增強(qiáng)， 呈明顯的劑量一時(shí)問 依賴關(guān)系。當(dāng)藥物濃度達(dá)到4 0 0 ／x m o l ／L 時(shí)， 4 8 h 后， 細(xì)胞基本全部死亡。利用作圖法測得作用4 8 h 和 7 2 h 后， I c 鍆值約為1 0 0 t~ m o l ／L 和7 5 ~ m o l ／L 。

 文獻(xiàn)報(bào)道， 白藜蘆醇對細(xì)胞周期所發(fā)揮的作用 主要針對其中的兩個(gè)環(huán)節(jié)， 即G 1 一S 和S — G 2 。A h — m a d 等一J 報(bào)道白藜蘆醇能以劑量和時(shí)間依賴方式誘 導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶( C D K ) 抑制蛋白 p 2 1 W A F 2 1 的產(chǎn)生， 并能減少細(xì)胞周期蛋白( c y c l i n ) D l 、D 2 、E 和C D K 2 、C D K 4 、C D K 6 的蛋白表達(dá)， 進(jìn)而造 成人表皮癌A 4 3 1 細(xì)胞的G l 期停頓， 使細(xì)胞不能完 成從G l 期至S 期的轉(zhuǎn)化， 并認(rèn)為這一過程是不可逆 的，將最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。還有研究則認(rèn)為白藜蘆醇還能通過阻斷S 期和G 2 期的進(jìn)展而抑制牛肺動(dòng) 脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖。P a r k 等則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇 在低濃度時(shí)能誘導(dǎo)S 期停頓， 濃度過高則反而無此 活性， 同時(shí)還認(rèn)為這一阻斷過程是可逆的。本實(shí)驗(yàn) 的結(jié)果顯示， 白藜蘆醇與T e a 細(xì)胞作用4 8 h 后， G 1 期細(xì)胞的比例明顯s ~ Dri ， 出現(xiàn)G l 期阻滯， 這與文獻(xiàn) 報(bào)道的一致。

 細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自身調(diào)節(jié)的主動(dòng)性死亡過程， 不引起炎癥反應(yīng)， 機(jī)體不會(huì)因此發(fā)生不良反應(yīng)， 因而細(xì)胞凋亡是腫瘤治療研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。白藜蘆醇以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式抗腫瘤無疑顯示了其 在腫瘤治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。在白藜蘆醇引起細(xì) 胞凋亡的研究中， 1 9 9 8 年， C 16 r n e n t 等首先報(bào)道了白藜蘆醇能通過C D 9 5 一C D 9 5 L 途徑( 即F a s — F a s L 途徑) 誘導(dǎo)H L 一6 0 細(xì)胞株和人乳腺癌細(xì)胞株T 4 7 D 發(fā)生凋亡， 而對正常人外周血淋巴細(xì)胞則無此作用。 此后，許多研究小組對其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制 進(jìn)行了研究， 結(jié)果顯示， 白藜蘆醇可能對凋亡發(fā)生過 程中的多個(gè)環(huán)節(jié)均有作用。采用不同的腫瘤細(xì)胞株 可能在一定程度上影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 或者說對于不同 的腫瘤細(xì)胞， 白藜蘆醇誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能大不相同。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示， T e a 細(xì)胞經(jīng)1 0 0 tl m o l／L 白藜蘆醇處理4 8 h 后， 細(xì)胞凋亡率高于對照組。