絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (ERK)、c—Jun氨基末端激酶(JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)三條經(jīng)典的亞族通路 J，其被脂多糖(LPS)等多種因素激活后可產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，促進(jìn)炎癥發(fā)生、發(fā)展，活化標(biāo)志是蛋白磷酸化形式表達(dá)量增多。目前白藜蘆醇因具有可靠而廣泛的抗炎作用日益受到重視，但具體機(jī)制尚未清楚。RAW264．7細(xì)胞為小鼠巨噬細(xì)胞系，常用于細(xì)胞炎癥方面的研究。2010年2月，我們觀察了白藜蘆醇 對(duì)RAW264．7細(xì)胞中LPS激活MAPK炎癥通路的影響，旨在進(jìn)一步探討其抗炎機(jī)制。
1 材料與方法
1．1 材料RAW264．7細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素—鏈霉素雙抗，血清，LPS，p38 MAPK、ERK、JNK及其磷酸化蛋白P— p38 MAPK、P．ERK、P JNK一抗和二抗，白藜蘆醇，內(nèi)參B—actin一抗、二抗，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK一8)，電泳緩沖液、RIPA細(xì)胞裂解液、蛋白上樣緩沖液、BCA 試劑盒。
1．2 不同濃度白藜蘆醇及LPS處理后RAW264．7 細(xì)胞活性測(cè)定將RAW264．7細(xì)胞懸液100 l按1 ×10 ／ml密度接種至96孔板中，置于37℃、5％ CO 培養(yǎng)箱中孵育24 h，至細(xì)胞良好貼壁后隨機(jī)分為空白對(duì)照組和處理組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。其中處理組分別加入不同濃度的白藜蘆醇(5、10、15、30 M)+LPS共同孵育，24 h后各組每孔加入CCK一8 溶液10 l孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)各孔吸光度(OD)。設(shè)僅加入DMEM培養(yǎng)基100 IXl者為調(diào)零組，空白對(duì)照組和處理組的細(xì)胞活性分別以其與調(diào)零組OD差值表示。
1．3 不同濃度白藜蘆醇及LPS處理后RAw264．7 細(xì)胞MAPK蛋白水平檢測(cè)① 白藜蘆醇及LPS處理：將RAW264．7細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS組、 LPS+白藜蘆醇組，均加入含10％FBS、100 U／ml青霉素、鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、 5％CO：下以1．5×10。／ml的密度接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁良好且生長(zhǎng)融合至約90％ 時(shí)，LPS+白藜蘆醇組加人適當(dāng)體積的白藜蘆醇使其濃度梯度分別為5、10、15 IXM，2 h后LPS組和LPS+白藜蘆醇組分別加入LPS至其終質(zhì)量濃度為1 g／ml，培養(yǎng) 30 rain。②MAPK蛋白水平檢測(cè)：RAW264．7細(xì)胞經(jīng)上述處理后，用冰冷PBS清洗終止反應(yīng)，加入含有磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，將細(xì)胞從培養(yǎng)皿刮離、冰上裂解30 min，取上清加上樣緩沖液，沸水中煮10 rain使蛋白變性，一20℃保存。配置SDS— PAGE凝膠，各個(gè)泳道蛋白等量上樣均為30 ，電泳結(jié)束后切膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗過(guò)夜，孵育二抗，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影和壓片，Western條帶用Quantity ONe軟件掃描灰度，用內(nèi)參灰度值進(jìn)行校正。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。
1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 13．0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以 ±s表示，采用One—way ANOVA 方差分析，P≤O．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2．1 三組RAW254．7細(xì)胞活性 空白對(duì)照組為 1．107 0±0．111 70，處理組白藜蘆醇濃度為5、lO、l5、 30 IxM者分別為1．400 8±0．126 04、1．227 1±0．203 41、1．172 7±0．156 58、0．695 6±0．047 13，白藜蘆醇 濃度為30 IxM處理組細(xì)胞活性顯著低于其他濃度處理者及對(duì)照組，P<0．05(F=10．625)。
2．2 三組MAPK磷酸化蛋白水平見(jiàn)表1。
3 討論
MAPK屬于絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族，能夠?qū)獯碳ば盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)成胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯后效應(yīng)。激活的MAPK可通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、酶類(lèi)等多種底物來(lái)調(diào)節(jié)炎癥、疼痛等多種病理生理過(guò)程。白藜蘆醇是虎杖的有效成分之一，具有保護(hù)心肌細(xì)胞、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、抵抗內(nèi)毒素休克、降血脂、抗脂質(zhì)過(guò)氧化及鎮(zhèn)咳、平喘、抗病原微生物等多種藥理作用。MAPK蛋白是否為白藜蘆醇抗炎的直接作用靶點(diǎn)，既往少有研究。本研究顯示，白藜蘆醇濃度在5—15 IxM時(shí)對(duì)RAW264．7細(xì)胞活性無(wú)明顯影響，達(dá)30 txM時(shí)可使細(xì)胞活性顯著降低。故本研究中選擇5—15 IxM白藜蘆醇進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示其可抑制MAPK家族中p38 MAPK、JNK 磷酸化，而對(duì)ERK磷酸化無(wú)明顯影響。提示抑制 MAPK炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能為白藜蘆醇抗炎機(jī)制之一，但該作用為直接I生或問(wèn)接陛尚需進(jìn)一步研究和證實(shí)。Nonn等 對(duì)前列腺腺上皮細(xì)胞的研究表明，白藜蘆醇可上調(diào)細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶5 水平，抑制IL。l、TNF一儀誘導(dǎo)的p38 MAPK炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，減少COX-2、IL-6、IL-8的產(chǎn)生。另有研究表明，白藜蘆醇可通過(guò)各種機(jī)制抑制NF．KB，減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生 J，從而發(fā)揮抗炎作用。因 NF ．cB很可能為MAPK的下游，白藜蘆醇的抗炎效果很可能是通過(guò)抑制MAPK—NF—KB通路實(shí)現(xiàn)的。
總之，5～15 IxM 白藜蘆醇可抑制LPS激活的 p38 MAPK、JNk磷酸化，此可能為其抗炎機(jī)制之一。 | 
白藜蘆醇對(duì)脂多糖激活RAW264.7細(xì)胞MAPK炎癥通路的影響 
