東北鐵線蓮(Clematis mandshurica Rupr．)為毛茛科鐵線蓮屬植物．主要分布于東北及內蒙北部地區(qū)，一般根部人藥，嫩葉、地上莖可食用，東北鐵線蓮中含有豐富的生物活性物質．主要用于治療風濕痹痛、關節(jié)不利等癥狀．現代藥理研究表明具有多種藥理作用，如解痙、鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤、利膽和降血壓等功效：
總黃酮作為一類重要的天然有機化合物．因其具有眾多藥理作用如抗癌抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌抗病毒、抗氧化抗衰老而越來越受到人們的關注．木犀草素是一種重要黃酮化合物。在自然界分布廣泛．具有良好抗氧化性和抗菌性．具有降低血脂和膽固醇．降壓及免疫雙向調節(jié)藥理作用．可作為食品天然抗氧化劑和防腐劑開發(fā)．具有廣闊開發(fā)與應用前景
目前關于東北鐵線蓮中總黃酮和木犀草素的含量測定尚未見報道．該文建立了東北鐵線蓮中總黃酮和木犀草素的含量測定方法．為東北鐵線蓮的綜合利用提供科學的理論依據.
1 材料與方法
1。1 材料與試劑
東北鐵線蓮購自安徽省毫州市華申藥業(yè)有限公司：木犀草素和蘆丁對照品均購自中國藥品生物制品檢定所(木犀草素批號1 1 1520—200504．供含量測定用：蘆丁批號100080—200707．供含量測定用)：甲醇(色譜純，天津大茂化學試劑公司)；水為二次蒸餾水：其余所用試劑均為分析純。
1．2 儀器
LC一10AD型高效液相色譜儀配備(日本島津公司)．SPD一10Avp紫外一可見檢測器：752N紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；超聲波藥品處理機f濟寧金百特電子有限責任公司佃T／C— YCL)：BP211D 型電子天平(Sagorius公司)；RT一08 手提式高速中藥粉碎機(大德樂機械有限公司)。
2 方法與結果
2．1 木犀草素含量測定 2．1．1 色譜條件 參照文獻l8_-1 3分別對甲醇～水、甲醇一0．2％(V／V)磷酸溶液和甲醇一0．4％(V／V)磷酸溶液三種流動相進行了選擇．結果表明甲醇一0．4％ (v／v)磷酸溶液為流動相時，分離度為3．158．理論塔板數為16 393．保留時間約為30 min左右．以梯度洗脫方式對木犀草素進行洗脫． 洗脫程序為0 min到15 min，40％A 到60％A：15 min到20 min． 60％A到70％ A；20 min到30 min，70％A到80％A； 30 min到35 min，80％A 到95％A：35 min到45 min．95％A；45 min到55 min，95％A 到30％A；55 min到60 min，30％A～停泵，其中A為甲醇，B為 0．4％(V／V)磷酸溶液。根據以上試驗結果確定色譜條件：色譜柱EI2]為Diamonsil C18(250 ram~4．6 rain， 5 m)；流動相為甲醇一0．4％磷酸溶液(V／V=30：70)；流速：1．0 mL／min，梯度洗脫；柱溫：40℃，進樣量20 L，檢測波長為350 nrn。分別取對照品溶液，供試品溶液各20 L，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定．記錄色譜圖。
本實驗采用紫外分光光度計對木犀草素對照品溶液進行全波長掃描，以甲醇作為空白試劑．結果木犀草素的最大吸收波長為350 nm與早期文獻報道一致，最終確定木犀草素的檢測波長為350nm。
2．1．2 對照品溶液的制備取木犀草素對照品適量。精密稱定，加甲醇配制為80 R,g／mL對照溶液。 2．1．3 供試品溶液的制備稱取2．0 g東北鐵線蓮藥粉。加入20mL甲醇。搖勻。超聲提取45 rain，靜置，冷卻至室溫，過濾，用5 mL甲醇清洗濾渣一次，過濾。合并濾液。轉移至25 mL容量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0．45 m微孑L濾膜過濾，作為供試品溶液。
2．1．4 方法線性范圍考察精密吸取木犀草素對照品適量，分別配制成濃度為O．5，1．O，2．0，4．0，8．0、 10．0和20．0 I~g／mL的梯度溶液．分別吸取各梯度溶液20 L，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以木犀草素對照品進樣濃度C(p~g／mL)為橫坐標，峰面積積分值 為縱坐標．繪制標準曲線。得回歸方程A= 666．870C+45．787．r=0．999 4，結果表明木犀草素進樣濃度在O．50～2O．00 I~g／mL范圍內呈良好的線性關系。
2．1．5 精密度實驗精密吸取線性關系項下濃度為10．0 I．Lg,／mL的對照品溶液，連續(xù)進樣5次，測定 木犀草素吸收峰面積積分值，RSD值為1．70％，表明本實驗精密度良好。
2．1．6 穩(wěn)定性實驗取同一供試樣品溶液．分別于配制后0，2，4，6，8 h進行測定，記錄木犀草素峰的峰面積。結果RSD值為1．06％。結果表明樣品溶液在8 h內穩(wěn)定。
2．1．7 重復性實驗取同一批東北鐵線蓮藥粉．按“2．1．3”項下的的制備方法制備5份供試品溶液，同條件測定．記錄木犀草素峰的峰面積，其RSD值為 1．21％。說明此方法重復性較好。實驗結果見表3。 2．1．8 加樣回收率實驗 稱取已知含量(30．013 g)的東北鐵線蓮藥粉2．00 g，共5份，分別精密加入木犀草素對照品溶液0．75 mL．按“2．1．3”項下的的制備方法制備5份供試品溶液．按2．1．1色譜條件測定 結果表明平均回收率為99．2l％，RSD值為2．72％。
2．1．9 樣品測定 取5份東北鐵線蓮藥粉．按 “2．1_3”項下的的制備方法制備供試品溶液．按2．1．1 色譜條件測定．測得木犀草素的含量分別為29．125、 29．020、30．788、30．348、30．578 g／g， 平均含量為 29．972 tzg／g，由此可知東北鐵線蓮中木犀草素的含量較低。
2．2 總黃酮含量測定
2．2．1 對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品 0．201 g，加60％(V／V)乙醇稀釋到100mL，搖勻，即得濃度為2．01 mg／mL的對照品溶液。
2．2．2 供試品溶液的制備稱取2．0 g東北鐵線蓮藥粉，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入60％(V／ )乙醇20mL，搖勻，超聲提取30min，靜置，冷卻至室溫，過濾，濾渣重復上述超聲提取過程1次，濾過，濾渣用5 mL 60％(v／v)乙醇清洗1次，過濾，合并2次所得濾液，加60％(v／v)乙醇定容至50 mL．搖勻．得供試品溶液。
2．2-3 檢測波長的選擇 吸取蘆丁對照品溶液和供試品溶液各2 mL于25 mL容量瓶中．加6O％(v／)乙醇4 mL，搖勻，靜置6 min，加5％(m／V)NaNO， 0．4 mL，搖勻，靜置6 min，加10％(m／V)A1(NO ) 0．4 mL，搖勻，靜置6 min，再加入4％(m／V)NaOH 4 mL，搖勻，用60％(V／V)乙醇定容到刻度．放置l5 min．同時作空白對照．在400～600 nm范圍內進行波長掃描[13 3．結果對照品溶液和供試品溶液均在 510 nm有最大吸收．由此確定檢測波長為510 nm 2．2．4 方法線性范圍考察分別精密移取0．1、0．2、 0-3、0．4、0．5、0．6 mL蘆丁對照品溶液于25 mL容量瓶中，加60％(V／V)乙醇4 mL．搖勻，靜置6 min，加 5％(m／V)NaNO 0．4 mL，搖勻，靜置6 min，加10％ (m／V)A1(NO3)3 0．4 mL，搖勻，靜置6 min，加4％ (m／V)NaOH 4 mL，搖勻，用60％(V／V)乙醇定容到刻度．放置15 min．同時作空白對照，分別在510 nm 波長處測定吸光度．以對照品濃度C(mg／mL)為橫坐標。吸光度A為縱坐標．繪制標準曲線。求得回歸方程A=11．748C+0．003．r=0．999 9．結果表明蘆丁進樣濃度在0．008 04～0．048 24 mg／mL范圍內呈良好的線性關系
2．2．5 精密度實驗 吸取標準曲線項下濃度為 0．016 08 mg／mL的蘆丁對照品溶液2 mL．按“2．2．4” 項下方法連續(xù)測定5次吸光度．記錄數據．結果 RSD值為0．95％．精密度良好
2．2．6 穩(wěn)定性實驗稱取2．0 g東北鐵線蓮藥粉，精密稱定．置50 mL容量瓶中，按“2．2．2”項下方法配制供試品溶液．按“2．2．4”項下方法．分別于配制后 0、30、60、90和120 min測定吸光度，RSD值計算結果為1．62％．表明供試品溶液在實驗條件下120 min 內基本穩(wěn)定．可滿足測定要求
2．2．7 重復性實驗取同一批東北鐵線蓮藥粉．按 “2．2．2”項下的制備方法制備5份供試品溶液．依法測定吸光度．結果RSD值為1．39％ ，重復性較好。 2-2_8 加樣回收率實驗稱取已知含量(4．425 mg／g) 的東北鐵線蓮藥粉約2 g，共5份，精密稱定，分別精密加人蘆丁對照品溶液2．0 mL．按“2．2．2”項下的制備方法制備5份供試品溶液．按“2．2．4”項下方法測定吸光度．結果表明平均回收率為99．34％．RSD值為1．97％ 實驗結果見表5
2．2．9 樣品測定 取5份東北鐵線蓮藥粉．按 “2．2．2”項下的的制備方法制備5份供試品溶液．按 “2．2．4”項下方法測定吸光度．結果測得總黃酮的含量分別為4．437、4．424、4．406、4．397、4．437 mg／g。
3 討論
3．1 高效液相色譜法檢測波長的選擇
文獻報道．采用高效液相色譜法測定木犀草素 含量時．一般分別在350 nm[9,1o1．254 nm E“]的檢測波長條件下進行了研究．本實驗采用紫外分光光度計對木犀草素對照品溶液進行全波長掃描．以甲醇作為空白試劑．結果木犀草素的最大吸收波長為350 nm．根據實驗結果和參考文獻確定350 nm為本實驗的檢測波長
3_2 高效液相色譜法分離柱的選擇
根據參考文獻rI2]．選擇的色譜柱為DiaInonsi!C18 (250 mmX 4．6 mm，5 m，)。
3．3 高效液相色譜法供試品溶液制備方法的選擇根據所查閱的文獻 ．本實驗以甲醇為溶劑．分別對熱回流法、索氏提取以及超聲提取3種提取方式進行選擇 結果熱回流法木犀草素峰面積、拖尾因子分別為720．906、2．07l，索氏提取法木犀草素峰面積、拖尾因子分別為637．400、2．179，超聲提取法 木犀草素峰面積、拖尾因子分別為1 552．300、 1．572．根據木犀草素的峰面積、拖尾因子確定超聲提取為較佳的提取方法．并在此基礎上進行了超聲次數、超聲時間進行了探索。
3．3．1 超聲次數的選擇本實驗考察了超聲次數對提取效果的影響，精密稱取2．0 g東北鐵線蓮粉末．提取2次，每次加入20 mL甲醇，每次超聲提取 45 min，過濾，分別收集1、2次提取液，將各次提取液分別置于25 mL容量瓶中．加甲醇定容至刻度。搖勻。用微孔濾膜(0．45 m)過濾，取濾液作為供試品溶液．按正文色譜條件進行含量測定．第1次提取液測得的木犀草素峰面積1 698．056．第2次提取液在相應的保留時間處沒有吸收峰．由此可見第2 次的提取量已經很小．故將提取次數確定為1次。 3-3．2 超聲時間的選擇 在超聲次數對提取效果的影響實驗的基礎上．進一步考察了超聲時間對提取效果的影響．精密稱取2．0 g東北鐵線蓮粉末．加入20 mL甲醇提取1次，分別超聲30、35、40、45、50 min．過濾，分別收集提取液，將各提取液分別置于 25 mL容量瓶中．加甲醇定容至刻度，搖勻．用微孔濾膜(0．45 m)過濾，取濾液作為供試品溶液，按上述色譜條件進行含量測定．木犀草素峰面積分別為 573．905、786，923、1 230．563、1 635．158、1 642．330，由結果可知木犀草素的峰面積隨著提取時間的增加而增加．但是當時間增加到45 min時，峰面積變化很小。故將超聲提取時間確定為45 min。
本實驗建立的總黃酮和木犀草素含量測定方法操作簡便。方法精密度高，重復性及線性關系良好�；厥章瘦^好，對于評價東北鐵線蓮的內在質量具有一定的參考意義. |
東北鐵線蓮中木犀草素及總黃酮含量的測定 NEWS
