木犀草素的體外抗炎機(jī)制研究 | 木犀草素的體外抗炎機(jī)制研究 |
| 發(fā)布時(shí)間:2013-12-10 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):1738 |
摘 要:【目的】觀察木犀草素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264．7細(xì)胞（小鼠單核／巨噬細(xì)胞系）核因子κB（NF-κB）和環(huán)氧合酶2（COX-2）表達(dá)及NF-κB DNA結(jié)合活性的影響，探討其體外抗炎機(jī)制�！痉椒ā恳訰AW264．7細(xì)胞為研究對象，選用對數(shù)生長期的細(xì)胞，分別設(shè)空白對照組，脂多糖（LPS）處理組（模型組），5、15、45μmol／L木犀草素處理組（中藥低、中、高劑量組）；加入藥物30min后再加入終濃度為1μg／mL的LPS繼續(xù)培養(yǎng)12h，分別采用酶免疫測定法（EIA）檢測木犀草素對RAW264．7細(xì)胞前列腺素E2（PGE2）生成的影響；電泳遷移率變動(dòng)分析法（EMSA）檢測NF-κB的DNA結(jié)合活性；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測定RAW264．7細(xì)胞中COX-2 mRNA的水平；Western blot法測定RAW264．7細(xì)胞中NF-κB和COX-2蛋白的表達(dá)�！窘Y(jié)果】木犀草素能顯著性抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細(xì)胞PGE2的生成，降低NF-κB的DNA結(jié)合活性；下調(diào)LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細(xì)胞COX-2 mRNA、mRNA和COX-2蛋白的表達(dá)�！窘Y(jié)論】木犀草素的抗炎作用可能與其能抑制核內(nèi)NF-κB的表達(dá)和DNA結(jié)合活性從而下調(diào)COX-2的表達(dá)有關(guān). 關(guān)鍵詞:木犀草素／藥理學(xué) 炎癥／中藥療法 信號(hào)傳導(dǎo) 基因表達(dá)調(diào)控 細(xì)胞培養(yǎng) Studies on In-vitro Anti-inflammatory Mechanism of Luteolin Abstract:[ Objective] To investigate the in-vitro anti-inflammatory mechanism of luteolin by observing the effect of luteolin on nuclear factor-kappa B （NF-κB） and COX-2 expression as well as DNA-binding activity of NF-κB in RAW264.7 ceils activated by lipopolysaccharides （LPS）. [ Methods ] RAW264.7 cells at logarithmic growth phase were allocated to blank control group, model group （treated with LPS） and luteolin groups （treated with 5, 15, and 45 μmol/ L luteolin respectively）. After being treated with luteolin for 30 rain and then incubated with 1μg/mL LPS for 12 hours, the change of prostaglandin E2 （PGE2） level was observed by enzyme immunoassay （EIA）, DNA-binding activity of NF- κB was detected by electrophoretic mobility shift assay （EMSA）, mRNA expression of COX-2 was examined by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）, and NF-κB and COX-2 protein expression in RAW264.7 cells was analysed by Western blotting. [ Results] Luteolin obviously inhibited the formation of PGE2, decreased DNA-binding activity of NF-κB and down-regulated mRNA expression of COX-2 as well as NF-κB and COX-2 protein expression in RAW264.7 ceils activated by LPS. [Conclusion] The anti-inflammatory mechanism of luteolin may be related with the down-regulation of COX-2 expression by inhibiting the expression of NF-tcB and DNA-binding activity. Key words:LUTEOLIN/pharmacology; INFLAMMATION/TCD therapy; SIGNAL TRANSDUCTION; GENE EXPRESSION REGULATION; CELL CULTURE 木犀草素(Luteolin)屬于黃酮類化合物，主要 存在于菊花、忍冬花、紫蘇葉等天然藥物中，研究 表明木犀草素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào) 節(jié)等多種作用[卜 ，木犀草素的抗炎作用與其抑制 炎癥介質(zhì)的釋放和核因子 B(NF-xB)介導(dǎo)的基因 表達(dá)有關(guān)[3-4]。本文觀察了木犀草素對脂多糖 (LPS)誘導(dǎo)的RAW264．7細(xì)胞NF_fcB表達(dá)、DNA結(jié) 合活性以及對環(huán)氧合酶一2(COX-2)表達(dá)的影響，以 進(jìn)一步探討木犀草素抗炎的作用機(jī)理。 1 材料與方法 1．1 藥品及試劑 木犀草素(純度>98％)和前 列腺素E2酶免疫分析試劑盒(PGE2 EIA Kit)均為 美國Cayman公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰 胺、二甲基亞砜(DMSO)、焦碳酸乙二酯(DEPc) 等為Sigma公司產(chǎn)品；RPMI一1640為Gibco公司產(chǎn) 品；超級(jí)小牛血清為杭州四季青生物工程公司產(chǎn) 品；總RNA提取試劑(Trizo1)為Invitrogen公司產(chǎn) 品；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)一步法試劑 盒為寶生物(大連)工程有限公司產(chǎn)品；100 bp DNAmarker、N，N，N。N．四甲基乙二胺(，IEMED)、6 倍上樣緩沖液均為華美生物工程公司產(chǎn)品；增強(qiáng)化 學(xué)發(fā)光(ECL)試劑、抑酞酶(Aprotinin)均購于 上海華舜生物工程有限公司；p—aetin山羊IgG多克 隆抗體、NF．fcB小鼠IgG單克隆抗體和COX一2山羊 IgG多克隆抗體均為北京中山公司產(chǎn)品；聚偏 (二)氟乙烯(PVDF)膜為美國Pall Gelman公司產(chǎn) 品；NF-xB寡核苷酸鏈為上海生物工程公司產(chǎn)品； 7_32p標(biāo)記三磷酸腺苷([7_32p]ATP)為北京亞輝 生物工程公司產(chǎn)品；T4噬菌體多核苷酸激酶為 Promega公司產(chǎn)品。 1．2 方法 1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264．7細(xì)胞(小鼠單核／巨 噬細(xì)胞系)購自上海細(xì)胞研究所，在37℃、體積 分?jǐn)?shù)為5％CO2條件下，用含體積分?jǐn)?shù)為10％小牛 血清、青霉素(1×lOs U／L)及鏈霉素(100mg／L) 的RPMI一1640培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。 1．2．2 PGE2含量測定 將對數(shù)生長期的 RAW264．7細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，設(shè)空白對照 組，脂多糖(u s)處理組(模型組)，5、15、45 pmol／L木犀草素處理組(中藥低、中、高劑量 組)；藥物加入30 min后再加入終濃度為1,g／mL 的LPS，繼續(xù)培養(yǎng)12 h；收集細(xì)胞培養(yǎng)液，以PGE2 EIA Kit測定其中的PGE2濃度，每組重復(fù)3次。 1．2．3 電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA) 細(xì)胞培養(yǎng) 及分組同1．2．2。細(xì)胞核蛋白的提�。杭�(xì)胞以冷磷 酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后加入100 緩沖液 A [10 mmol／L N 2．羥基哌嗪．N．2．乙磺酸(HEPES) 一KOH、1．5 mmol／L M[gC12、10 mmol／L KC1、1 mmol／L苯甲基磺酰氟(PMSF)、10 mg／L Leupeptin、 3．5 mg／L抑酞酶(Aprotinin)、1 mmol／L二硫蘇糖醇 (DTF)]，冰上放置15 min，再加體積分?jǐn)?shù)為10％壬 基酚聚氧乙烯醚(NP．40)10 ，振蕩混勻；然后 10000 g、4 oC、離心10rain；于沉淀中加100 緩 沖液B l 20 mmol／L HEPES．KOH、2．7 mol／L甘油 (Glycero1)、420 mmol／L NaC1、1．5 mmol／L M l2、1 mmol／L PMSF、1 mg／L Leupeptin、10 mg／L Aprotinin、 1 mmol／L DTr]，冰浴30 min，離心取上清液，考馬 斯亮藍(lán)法測定核蛋白濃度后， 一70℃保存。 雙鏈寡核苷酸探針的標(biāo)記：含有NF．KB特異性 識(shí)別位點(diǎn)的雙鏈脫氧寡核苷酸序列如下：5’． AGT AGGGGAC CCAGGC-3’；3’-TCAACTCCCC TGAAAG( T℃cG5’。依次加入寡核苷酸探針(1O pmol／ )1．0 、10倍T4多核苷酸激酶緩沖液2 、T4多核苷酸激酶(1O u／ )1．0 、[．,／_32p] 一ATP(10 uCi／t,-L)2．5 、無核酸酶水13．5 ， 共2O 。反應(yīng)混合液于37℃孵育10 min，加入0．5 mmol／L乙二胺四乙酸(EDTA)1 終止反應(yīng)。乙 醇沉淀法去除未結(jié)合標(biāo)記物。 取1O 核蛋白與放射性核素標(biāo)記的DNA探針 在室溫進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)30 min，總體積為1O 。DNA一 蛋白復(fù)合物經(jīng)40 g／L的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳， 電壓110V，電泳60min。真空負(fù)壓加熱干燥凝膠后， 一70℃放射自顯影，顯影后掃描至計(jì)算機(jī)。用 Bandsean 4．3圖像分析軟件進(jìn)行光密度積分值分析。 每個(gè)圖像均重復(fù)分析3次，取平均值。 1．2．4 RT-PCR測RAW264．7細(xì)胞中COX一2 mRNA 的表達(dá)RAW264．7細(xì)胞分組及處理同1．2．2。收 集細(xì)胞，用Tfizol試劑提取細(xì)胞的總RNA，按一步 法試劑盒步驟進(jìn)行RT．PCR。COX．2引物為：上游 5’一GGGAAGCCrIT] CAACC一3’，下游5’一GAACCCA GGTCCTCGCTr-3’，產(chǎn)物長度為245 bp；B—actin引物 為：上游5’一CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC一3’， 下游5’一AGGGTACA CCGCCAGAC一3’， 產(chǎn) 物長度為587 bp。COX一2的反應(yīng)條件為：5O℃逆轉(zhuǎn) 錄30 rain；94 oC預(yù)變性2 min；94 oC變性45 S，56℃復(fù)性1 min，72 oC延伸1 min，擴(kuò)增3O個(gè)循環(huán)； 72~(2延伸10 min。PCR產(chǎn)物以15 L瓊脂糖凝膠電 泳，Doc Gel 1000成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。同時(shí) 進(jìn)行光密度積分值分析，以COX．2 PCR產(chǎn)物與內(nèi) 參照B．a(chǎn)ctin PCR產(chǎn)物的光密度積分值之比作為 COX．2 mRNA的相對含量值。 1．2．5 Western blot測RAW264．7細(xì)胞中COX．2和 NF．tcB蛋白的表達(dá) 細(xì)胞處理同1．2．2，細(xì)胞裂解 液裂解細(xì)胞后提取總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定樣品 總蛋白含量。每組各取5O 蛋白質(zhì)樣品加上樣緩 沖液煮沸變性后，進(jìn)行100 g／L十二烷基硫酸鈉一 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS．PAGE)；電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜；用含5O L脫脂奶粉的 s緩沖鹽溶液 (TBS，pH 8．0)封閉2 h；分別加入適量COX．2、 NF．KB和~-actin多克隆抗體，搖床上室溫反應(yīng)2 h； 洗膜3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫反 應(yīng)2 h；洗膜后作ECL化學(xué)發(fā)光，x片曝光顯影。 圖像經(jīng)掃描儀掃描后，用圖像分析軟件BandScan 4．3進(jìn)行光密度積分值分析，以目的蛋白與內(nèi)參照 ~-actin蛋白表達(dá)量的光密度積分值之比作為目的蛋 白表達(dá)量的相對含量值。 1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。 2 結(jié)果 2．1 木犀草素對RAW264．7細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)PGE2 生成的影響 表1結(jié)果顯示，空白對照組腳264．7 細(xì)胞中PGE2生成很低，當(dāng)加入誘導(dǎo)劑LPS后，PGE2 的生成顯著性增加，而15、45 tmaol／L木犀草素組中 的PGE2生成顯著性下降，表明中、高劑量的木犀草 素可顯著性抑制PGE2的生成。 表1 木犀草素對RAW264．7細(xì)胞中LPS誘導(dǎo) PGE2生成的影響 Table 1 Efects of luteolin on LPS-induced PGE2 synthesis in RAW2_54．7 cells(膏±S)
統(tǒng)計(jì)方法：單因素方差；① ：P<0．01，與空白對照組比較( the blank control group)；② ：P<0．01，與模型組比較(協(xié)themodel group 2．2 木犀草素對RAW264．7細(xì)胞中NF．xB的DNA 結(jié)合活性的影響 由圖1可見，空白對照組 RAW264．7細(xì)胞核蛋白中僅有少量NF．xB與特異性 寡核苷酸探針結(jié)合；而模型組細(xì)胞內(nèi)NF．xB活性明 顯高于空白對照組，低、高劑量的木犀草素明顯抑 制了NF．xB的DNA結(jié)合活性。 2．3 木犀草素對RAW264．7細(xì)胞COX．2 mRNA表達(dá) 的影響 圖2結(jié)果表明，空白對照組中RAW264．7 細(xì)胞COX．2 mRNA的基礎(chǔ)表達(dá)很低，而LPS可以明 顯上調(diào)RAW264．7細(xì)胞COX．2 mRNA的表達(dá)量，加 入濃度為15、45 tlmol／L的木犀草素后，COX．2 mRNA的表達(dá)均明顯下降，表明中、高劑量的木犀 草素可顯著性抑制COX．2 mRNA表達(dá)。 2．4 木犀草素對LPS誘導(dǎo)的RAW264．7細(xì)胞中NF- 和COX．2蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯 示，終濃度為1 meVL LPS處理細(xì)胞后，NF-xB和 COX．2蛋白條帶明顯變粗，木犀草素處理組NF．xB 和COX．2的蛋白表達(dá)量經(jīng)圖像分析結(jié)果顯示：15、 45 tlmol／L木犀草素處理組分別與模型組比較，NF． B和COX．2蛋白表達(dá)均明顯降低，表明中、高劑 量的木犀草素可顯著性抑制NF．xB和COX．2蛋白表 達(dá)(圖3)。 3 討論 NF-xB是普遍存在于細(xì)胞漿中的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，涉及免疫和炎癥反應(yīng)的快速早期基因激活 和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有和某些基因啟動(dòng)子區(qū)的特定核苷 酸序列結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的功能l_5 J。典型的NF． fcB是由p50和p65組成的異二聚體，它與抑制性蛋 白IxB結(jié)合而為非活性狀態(tài)，IxB通過錨蛋白重復(fù) 序列和NF-xB的Rel同源結(jié)構(gòu)域相互作用，遮蓋了 NF．s：B上的核定位序列，從而使NF-xB滯留于胞 質(zhì)。NF．xB可以被許多刺激劑如細(xì)胞因子、氧化 劑、病毒氧化劑、病毒激活，被激活的NF．xB與 IxB解離，轉(zhuǎn)入核內(nèi)與靶基因的特異位點(diǎn)結(jié)合，調(diào) 控基因轉(zhuǎn)錄l_6一 7l。
圖1 木犀草素對Ra,W2fi4．7細(xì)胞中NF．KB的 DNA結(jié)合活性的影響 [q~ ro 1 Effec【s of Iuteolin on廿_Ie NF-v．B bind activity in ind Iced R V 、弭．7 cells detected bv日 sA 研究表明L8j，COX．2啟動(dòng)子上含有NF．fcB位點(diǎn) 序列，NF．fcB是啟動(dòng)COX．2轉(zhuǎn)錄激活的重要轉(zhuǎn)錄因 子。LPS可激活巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)COX．2的高表達(dá)， LPS首先與細(xì)胞表面的脂多糖結(jié)合蛋白 (1ipopolysaccharide binding protein，LBP)結(jié)合，LBP 將LPS運(yùn)送到巨噬細(xì)胞膜上與CD14結(jié)合，從而激 活胞內(nèi)PKA和(或)PKC和(或)MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終引起IxB的磷酸化和降解，使NF-xB從 NF．xB．KBs復(fù)合物解離并活化，激活的NF．xB轉(zhuǎn)位 到細(xì)胞核內(nèi)與COX．2基因上NF．tcB位點(diǎn)序列結(jié)合， 啟動(dòng)COX．2的轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致COX．2高表達(dá) 9， 從而產(chǎn)生大量的PGE2。PGE2是一種重要的炎癥介 質(zhì)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中疼痛和發(fā)熱的產(chǎn)生。
本研究結(jié)果表明：濃度為15、45／．tmol／L的木犀草素能顯著性抑制LPS誘導(dǎo)的PGE2生成，并下 調(diào)LPS誘導(dǎo)的COX．2mRNA和蛋白表達(dá)，提示木犀 草素通過降低COX．2 mRNA表達(dá)，使COX．2蛋白生 成減少，從而抑制COX．2介導(dǎo)的PGE2生成。結(jié)果 還發(fā)現(xiàn)木犀草素可顯著性抑制NF．xB的蛋白表達(dá)及 其DNA結(jié)合活性，表明木犀草素除了通過下調(diào)NFfcB 表達(dá)，還可能通過影響其他與NF-xB DNA結(jié)合 活性密切相關(guān)的因素，最終抑制NF-xB的DNA結(jié) 合活性。研究結(jié)果提示木犀草素的抗炎作用與其抑 制COX．2表達(dá)和P 的生成有關(guān)。而木犀草素對 COX．2表達(dá)的抑制作用則可能與其抑制NF-xB的表 達(dá)，降低NF．xB DNA結(jié)合活性密切相關(guān)，這可能是 木犀草素抗炎的主要作用機(jī)制之一。 |
