木犀草素生物活性研究 | 木犀草素生物活性研究 |
| 發(fā)布時(shí)間:2013-12-10 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):1788 |
摘 要:該文報(bào)道對(duì)木犀草素抗氧化活性及抗菌活性研究。結(jié)果表明：木犀草素添加量以0．02％為宜。其效果與同劑量BHT相當(dāng)，比同劑量茶多酚抗氧化效果好。還原能力和消除羥自由基能力均比茶多酚和BHT強(qiáng)；且對(duì)食品中常見供試四種菌具有高效抗菌活性。并隨濃度增加而增強(qiáng)。對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、啤酒酵母和大腸桿菌完全抑制濃度分別為300mg／L、200mg／L、250mg／L、300mg／L。具有高效抗菌活性；表明木犀草素作為食品天然防腐劑和天然抗氧化劑具有開發(fā)潛力。 關(guān)鍵詞:木犀草素 抗菌活性 抗氧化活性 天然防腐劑 Research on Biological Activity of Nature Luteolin Abstract:This paper studied the antioxidative effect and the antimicrobial activity. It was found that the optimum quantity luteolin added to the reaction mixture was 0.02%, which was equivalent to BHT and stronger than that of GTP at the same dosage. The reducing power and ·OH scavenging ability in luteolin are better than in BHT and GTP. It against four kind of common food contaminative microorganism is determined. Result showed the minimal inhibition concentration （MIC） were 300 mg/L against Staphylococcus aureus, 200 mg/L against Bacillus subtilis, 250 mg/L against beer yeast, 300 mg/L against Escherichia coll. It have high antimicrobial activity. All of these results confirm that luteolin is of potential value and cxploition in food industry Key words:luteolin; antimicrobial activity; antioxidative activity; natural food antiseptic 食品遭受微生物污染會(huì)腐敗變質(zhì)，因而要加入防 腐劑抗菌、并添加抗氧化劑以延長(zhǎng)食品保質(zhì)期。常用 的一些化學(xué)防腐劑如苯甲酸鈉已引起消費(fèi)者對(duì)其安 全性質(zhì)疑，故科研工作者把注意力轉(zhuǎn)向天然防腐劑研 究開發(fā)利用上，從植物中尋找有抗菌、抗氧化作用且 安全性高的活性物質(zhì)。 木犀草素是一種有代表性天然黃酮⋯，其具有抗 氧化性，可用以抑制油脂食品劣變 。有關(guān)藥理及臨床 試驗(yàn)結(jié)果表明，木犀草素有抗菌、抗病毒及降血壓、降 血脂作用¨ 。經(jīng)對(duì)數(shù)百例支氣管炎患者臨床研究表明， 其有效率超過90％，完全緩解者達(dá)63．8％，能對(duì)咳嗽有效 緩解：且經(jīng)檢測(cè)并未對(duì)肝臟、心臟或腎臟有所損害¨ 花生，我國(guó)常年栽培面積達(dá)3，000萬畝，年產(chǎn)莢果 600萬噸。按含殼33％計(jì)算，可得殼約200萬噸 。果 殼現(xiàn)大部分用作燃料，直接影響花生綜合利用價(jià)值。 花生殼除含有較多碳水化合物及粗纖維外，還含有少 量黃酮類化合物，主要為木犀草素(毛地黃黃酮，Luteolin)， 花生殼甲醇提取物中木犀草素含量為12．6％ 。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)花生殼乙醇提取物中分離純化木犀草素進(jìn) 行其抗菌和抗氧化活性研究。 1材料與方法 1．1材料和儀器 山東臨沂產(chǎn)新鮮成熟花生殼：試驗(yàn)菌種為金黃色 葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)和啤酒酵母( ． cherichiacolO；豬油為頹鮮豬板油熬制；現(xiàn)榨芝麻油，茶 多酚和BHT均為食用級(jí)(廣州食品添加劑公司)；理化試 劑(分析純)。 RE一52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)： UV-265型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)：超凈工 作臺(tái)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。 1．2 實(shí)驗(yàn)方法 l-2．1木犀草素制備 將新鮮成熟花生殼清洗。晾干，粉碎過400目篩， 準(zhǔn)確稱取1000g，用95％乙醇。70~C提取三次，每次水浴 加熱回流3小時(shí)；過濾殘?jiān)�，合并濾液，真空濃縮干燥。 石油醚脫脂。再用堿溶解酸析出去雜，經(jīng)硅膠柱層析分 離純化。用95％乙醇重結(jié)晶獲得純度為98％木犀草素。 1．2．2抗氧化能力測(cè)定 1．2．2．1硫代巴比妥酸(TBA)快速測(cè)定法 將木犀草素和BHT分別以設(shè)計(jì)添加量(均為質(zhì)量 比)加入芝麻油中置于60"C烘箱中恒溫，24小時(shí)后進(jìn) 行測(cè)定。具體為：取需要測(cè)定油樣l m1分別加入2 ml 20％-氯乙酸，與2ml 0．28％硫代巴比妥酸溶液，混勻后 沸水浴15min，冷卻加5ml氯仿，取上清液于532nnl下 比色。試驗(yàn)重復(fù)兩到三次，用A532平均值比較其抗氧化 性強(qiáng)弱。 1．2．2．2清除·OH能力測(cè)定方法 用FeSO4和H202產(chǎn)生·OH，以·OH氧化水楊酸 鈉所得產(chǎn)物吸光值表示·OH多少，吸光值越小，則·OH 越少，清除效果越好。 不同抗氧化劑溶解后置于離心管中，定容至1 ml， 加入12mmol／L水楊酸鈉0．5ml，0．9mol／LFeSO40-5ml， 最后加18 mmol／L H202 l ml啟動(dòng)反應(yīng)，37℃恒溫水浴 反應(yīng)l h后，5000 r／min離心10 min，取上清液并稀釋 至l0 ml，在510 nlT1分光光度計(jì)上測(cè)吸光值A(chǔ)，根據(jù)以 下公式計(jì)算·OH清除率。 清除率(％)=[{A一(A1一A2)}／a]×100％ A：不加抗氧化劑時(shí)體系吸光值； A1：加入提取液后體系吸光值； A2：提取液本底吸光值。 1．2．2-3還原能力測(cè)定方法 取不同抗氧化劑溶解并稀釋至2．5 ml，加入0．2 mol／L 且pH6．6磷酸鈉緩沖溶液2．5 ml及l(fā)％赤血鹽2．5 ml， 于50℃水浴反應(yīng)20 min后急速冷卻。加入10％三氯 乙酸溶液2．5 ml，于3000 r／min離心10 min，取上清液 5ml，加入蒸餾水4ml及0．1％三氯化鐵溶液l ml，混 合均勻，10 min后于700 am測(cè)定其吸光值，吸光值越 大，表示還原能力越強(qiáng)。 1．2-3抗菌能力測(cè)定 抗菌能力測(cè)定采用試管稀釋法 取兩環(huán)斜面菌種于5 ml液體培養(yǎng)基(肉湯膏10 g、 蛋白胨10 g、葡萄糖1 g、NaC1 5g和水1000ml組成， pH調(diào)到7．2)在37~C(酵母27"C)培養(yǎng)6 h，顯微鏡下觀 察計(jì)數(shù)，調(diào)整到含菌10 ～10 ／mL備用。 用液體培養(yǎng)基將木犀草素釋成不同濃度，滅菌 鍋中滅菌，待冷至室溫后，超凈工作臺(tái)中，在無菌條 件下接種50 l制備好菌種，同時(shí)設(shè)吐溫一80接菌和 對(duì)應(yīng)濃度藥物不接菌，重復(fù)三次。培養(yǎng)箱中37"C(酵 母27℃)培養(yǎng)24 h后，在640 nlTl測(cè)定吸光度，以吸 光度為縱坐標(biāo)，藥物濃度為橫坐標(biāo)繪制抑菌曲線。曲 線中吸光度開始下降濃度為起始抑菌濃度，吸光度 降到和對(duì)應(yīng)藥物不接菌吸光度相等時(shí)濃度為完全抑 制濃度(MIC)。從完全抑制后各管中取50 l接種于平板培養(yǎng)基中再培養(yǎng)48 h，以不長(zhǎng)菌為殺菌濃度 (MBC)。 2結(jié)果與分析 2．1抗氧化劑添加量與抗氧化效果 表1 TBA比色法測(cè)定A5∞平均值
由表1列示木犀草素和BHT以三個(gè)添加水平加入 豬油中采用快速測(cè)定法試驗(yàn)結(jié)果，由表1可見，木犀草紊 具有良好抗脂質(zhì)氧化能力，其最適添加量為0．02％左右。 2．2木犀草素還原能力和清除·OH能力 木犀草素清除·OH能力測(cè)定結(jié)果如圖l所示。
圖1 清除·0H能力比較 木犀草素還原能力測(cè)定結(jié)果如圖2。
圖2 還原能力比較 木犀草素具有供氫能力，H 與自由基結(jié)合，使之 還原為惰性化合物或穩(wěn)定自由基，從而可清除機(jī)體內(nèi) 過多有害自由基。羥自由基是毒性最大活性氧，對(duì)細(xì) 胞內(nèi)DNA破壞作用最大 ，活性氧所導(dǎo)致DNA損 傷在細(xì)胞里積累被認(rèn)為是機(jī)體老化主要原因 。黃酮 B環(huán)鄰二酚羥基(3’，4’一鄰二羥基)存在極大增強(qiáng)其 抗氧化活性，可認(rèn)為這是黃酮類高效抗氧化劑結(jié)構(gòu)基 礎(chǔ)¨ 。而木犀草素結(jié)構(gòu)為3’，4’，5，7-四羥基黃酮，因 此其B環(huán)鄰二酚羥基是清除羥自由基的關(guān)鍵功能 團(tuán)。從圖1、圖2可看出，隨著添加量增加，清除率和 還原能力都在增強(qiáng)。當(dāng)木犀草素加入量為0．05％時(shí)， 對(duì)羥自由基清除率達(dá)96．02％ ，明顯高于BHT，比茶 多酚略好。 2．3木犀草素抑菌曲線測(cè)定結(jié)果
圖3 木犀草素對(duì)枯草桿菌抑菌曲線
不同濃度木犀草素對(duì)枯草桿菌等菌抑制結(jié)果見 圖3～ 圖6。從圖中可看出：當(dāng)木犀草素濃度增大到 50 mg／L時(shí)，吸光度開始降低，說明隨濃度增加，菌的 生長(zhǎng)受到抑制數(shù)量在減少，此濃度為起始抑菌濃度： 當(dāng)濃度高到200 mg／L，吸光度值降到與藥物不接菌線 重合，說明此時(shí)菌生長(zhǎng)受到完全抑制，此濃度為完全 抑菌濃度。從圖3～ 圖6可看出，對(duì)枯草桿菌起始抑制 濃度為50 mg／L，完全抑制濃度為200 mg／L；對(duì)金黃 色葡萄球菌起始抑制濃度為25 mg／L，完全抑制濃度 為300 mg／L；對(duì)大腸桿菌起始抑制濃度為50 mg／L， 完全抑制濃度為300 mg／L；對(duì)啤酒酵母起始抑制濃度 為25 mg／L，完全抑制濃度為250 mg／L。實(shí)驗(yàn)測(cè)得供 試驗(yàn)菌種MBC見表2。 表2 木犀草素殺菌MBC值(m#L)
3結(jié)論 TBA快速測(cè)定法結(jié)果表明，木犀草素在芝麻油中 顯示良好抗氧化性，有效濃度為0．02％。在此濃度下， 木犀草素在芝麻油和豬油中抗氧化效果與BHT相近， 在豬油中抗氧化能力比茶多酚強(qiáng)。且木犀草索還原能力 和清除羥自由基能力均比茶多酚和BHT強(qiáng)。木犀草素 對(duì)食品中常見供試四種菌具有高效抗菌活性，且隨濃度 增加而增強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、啤酒酵母和 大腸桿菌完全抑制濃度分別為300 mg／L、200 mg／L、 250 mg／L、300 mg／L；表明木犀草素作為天然防腐劑和 抗氧化劑具有很好開發(fā)潛力，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著 廣泛應(yīng)用前景。 |
