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   齊墩果酸(oleanolic acid)又名慶四素，是～ 種 五環(huán)三萜類(lèi)化合物， 以游離或結(jié)合成苷的形式存在 于白花蛇舌草、山楂、丁香、大棗、女貞子、枇杷 葉、橡木、夏枯草等植物中⋯�，F(xiàn)代研究表明齊墩 果酸具有護(hù)肝降酶、抗炎、強(qiáng)心利尿、抗腫瘤等作 用，其制劑除廣泛應(yīng)用于急、慢性肝炎的輔助治療 以外，還可以配合腫瘤病人的手術(shù)、放療、化療， 促進(jìn)病人免疫功能恢復(fù)121。許多中藥及其制劑皆以 齊墩果酸為定量指標(biāo)，本文對(duì)齊墩果酸的定量方法 作一綜述。

 1 薄層分離一分光光度法

 董海麗等采用薄層分離 分光光度法測(cè)定木瓜 中齊墩果酸含量。準(zhǔn)確稱(chēng)取5譬木瓜皮，30mL甲 醇， 回流萃取10 h，冷卻后過(guò)濾，濃縮， 濾液置 于10mL容量瓶，定溶，制成樣品溶液。移取20／．tL樣 品溶液，在硅膠板上點(diǎn)樣， 同時(shí)在硅膠板上點(diǎn)齊墩 果酸對(duì)照品溶液作為對(duì)照樣，采用氯仿：丙酮(4：1)為 展開(kāi)劑展開(kāi)， 在對(duì)照品部位噴10％硫酸乙醇， 放 入105。C烘箱中烘10-15min顯色。刮去紫紅色部位相 對(duì)應(yīng)的硅膠， 甲醇洗脫，置于10mL容量瓶，定溶。 在最大吸收波長(zhǎng)210nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算樣品中齊墩果酸的含量。

 采用薄層掃描法和高效液相色譜法測(cè)定， 需要薄層掃描儀和高效液相色譜儀等精密儀器； 而采 用分光光度法測(cè)定，雜質(zhì)下擾較大，測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn) 確。如果先采用薄層色譜塒齊墩果酸進(jìn)行分離，然 后用分光光度法進(jìn)行測(cè)定，有效消除了雜質(zhì)干擾， 方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確。

 2 高效液相色譜法

 2．1 HPLC—UV法

 姚榮成等14]采用HPLC—uV法測(cè)定女貞子 中齊墩果酸含量。色譜條件：LC一2010液相 色譜儀(日本島津) ， 色譜柱：Phenomenex Luna C18柱(250mmx4．6mm，5／2m)； 流動(dòng)相： 乙腈：0_4％磷酸溶液(80：20)； 檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm； 進(jìn)樣量：10yL， 流速：1 mL／min； 柱溫：25。c。 精密吸取對(duì)照品溶液 (0。80g／L)0。2，0．5， t．0，2．0，5．0， 10．OpL進(jìn)樣， 記錄色譜圖。以峰面積積分值(Y)對(duì)進(jìn)樣量 (X)進(jìn)行回歸處理， 求回歸方程。取5批樣品的 粉末(過(guò)4號(hào)篩)各1 g，加入甲醇25mL，稱(chēng)定， 加熱 回流提取1h，放冷，再稱(chēng)定，用甲醇補(bǔ)足減失的重 量，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液，分別測(cè)定。

 石心紅等 測(cè)定齊墩果酸含量所用的色譜條 件：Agilent 1 100高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱：shim． Pack型C18(4．6ramx150mm) ， 流動(dòng)相： 乙腈：甲 醇：水：乙酸胺(70：16：14：0．5)， 流速1mL／min，檢測(cè)波 長(zhǎng)：215nm。戚志華，趙蓉，江鐵軍等分別采 用HPLC對(duì)齊墩果酸測(cè)定，色譜條件與石心紅所用條件基本相同。

 齊墩果酸分子中只有1個(gè)雙鍵，紫外末端吸收。 當(dāng)使用uV檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相應(yīng)盡量選用乙腈，減少 對(duì)測(cè)定的影響。在同時(shí)測(cè)定齊墩果酸和熊果酸含量 時(shí)，可適當(dāng)加入一定量甲醇，使兩種物質(zhì)達(dá)到更好 的分離19]。另外加入少量磷酸[1o1， 乙酸胺⋯]等物質(zhì) 可改變峰型。

 2．2 HPLC—ELSD法

 李會(huì)軍等采用HPLC—ELSD法測(cè)定金銀花 中齊墩果酸含量， 使用Alltima Cl8(4．6mmx250 mm，5／~m)色譜柱，柱溫25。C， 乙腈：水(85：15)為流 動(dòng)相， 以ELSD檢測(cè)器檢測(cè)，漂移管溫度75。c，載氣 流速1．9L／min，對(duì)金銀花中齊墩果酸進(jìn)行分離與測(cè) 定。

 ELSD檢測(cè)器為質(zhì)量型通用檢測(cè)器，可檢測(cè)任何 揮發(fā)性低于流動(dòng)相的化合物，避免使用UV檢測(cè)器時(shí) 溶劑的干擾。采用ELSD測(cè)定時(shí)，其峰面積值與對(duì)照 品濃度的線(xiàn)性關(guān)系不太理想，而將峰面積與對(duì)照品 濃度值分別取自然對(duì)數(shù)后可得到理想的線(xiàn)性關(guān)系， 這與ELSD檢測(cè)器的檢測(cè)機(jī)制是一致的[131。

 2．3 HPLC—MS法

 楊宜華等采用HPLC—MS法測(cè)定齊墩果酸的含量。色譜與質(zhì)譜條件： 色譜 柱Hypersil ODS C18(150mmx4．6mm，5Jum)； 流 動(dòng)相： 甲醇：0．05％ 冰醋酸(75：25)； 柱溫45。C； 流 速0．2mL／min， 進(jìn)樣量5／／L。質(zhì)譜大氣壓化學(xué)離 子化(APCI)探頭，離子掃描確定選擇離子流 (SIM) 為457， 正離子模式。APCI 400。C，CDL 250。C， BLOCK 250。C。

 采用HPLC—MS法， 其優(yōu)勢(shì)就在于進(jìn)一步鑒定 峰， 除了利用色譜圖的保留時(shí)間，還可根據(jù)質(zhì)譜圖 的荷質(zhì)比，此方法是目前較先進(jìn)的分析方法，應(yīng)用也越來(lái)越多。

 3 氣相色譜法

 閏花麗等以重氮甲烷為衍生化試劑，將齊墩果酸和熊果酸制成易氣化的甲酯衍生物，然后采用 氣相色譜法并以氫火焰檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)夏枯草 中的齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行了定量分析。重氮甲烷 與羧基的反應(yīng)簡(jiǎn)單、快速、產(chǎn)率高，但重氮甲烷需 在實(shí)驗(yàn)室制備，且毒性大，活性高，易分解甚至爆 炸U61

 黃建林等H7]以BSTFA為衍生化試劑， 將齊墩果酸和熊果酸制成三甲基硅烷衍生物， 應(yīng)用氣 相色譜一質(zhì)譜(GC MS)聯(lián)用技術(shù)， 對(duì)番石榴葉 中的齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行了定性和定量分 析。色譜條件：HP 6890 GC／5973 MS氣相色譜一 質(zhì)譜聯(lián)用儀，DB一5 MS彈性石英毛細(xì)管柱(30m ×0．25 mm，0．25#m) ， 進(jìn)樣口溫度280。C， 高純 氦氣為載氣， 流速1．0mL／min， 柱初溫100。C， 恒 溫保持2 min， 以10。C／min的速度升溫至300。C，保 持14min，進(jìn)樣量1 L。EI電離源， 電子能量70eV， 掃描范圍40~700#， 四級(jí)桿溫度150。C， 離子源 溫度230。C，GC—MS接口溫度280。C。樣品測(cè)定： 稱(chēng)取0．50g干燥的番石榴葉置于微波萃取罐中， 加10ml甲醇， 將密閉的萃取罐置于微波萃取儀 內(nèi)，80。C加熱10 min。待萃取罐冷卻后， 過(guò)濾， 殘?jiān)�用甲醇清�?—3次， 合并濾液和洗滌液， 置 于10mL容量瓶，定溶。取20#L萃取液至2mL樣品瓶 中， 用N2氣吹干后，~n30#L BSTFA，蓋緊蓋子， 振搖0．5rain， 在70。C條件下加熱30 min，進(jìn)行衍生 化。取I#L進(jìn)樣， 測(cè)定齊墩果酸和熊果酸的峰面 積，計(jì)算番石榴葉中齊墩果酸和熊果酸的含量。

 氣相色譜法測(cè)定齊墩果酸含量準(zhǔn)確度較高，但 齊墩果酸分子中含有羥基和羧基，熔點(diǎn)3l0。CIl8]，揮 發(fā)性差，不能直接使用氣相色譜進(jìn)行測(cè)定，一般先 將其衍生，然后再測(cè)定。

 4 毛細(xì)管電泳法

 劉海興等采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定夏枯草中齊墩果酸和熊果酸含量。色譜條件：Waters Quanta 400OE型毛細(xì)管電泳儀(Milford，MA，USA) ， 帶有0．30kV電壓， 陰極末端附近的固定波長(zhǎng)紫外 檢測(cè)器和恒溫系統(tǒng)。毛細(xì)管(河北永年光導(dǎo)纖 維廠， 直徑75／~m)總長(zhǎng)60cm， 有效長(zhǎng)度52cm。數(shù) 據(jù)處理由Waters Millennium 2010色譜管理軟件完 成。以15mmol／L磷酸氫二鈉、15 mmol／L硼砂、10 mmol／L十二烷基硫酸鈉(SDS)、5％ (V，V )乙醇 的緩沖溶液作為運(yùn)行電解質(zhì)溶液，在20rain內(nèi)實(shí)現(xiàn)了齊墩果酸和熊果酸的基線(xiàn)分離。

 肖美添等采用膠束毛細(xì)管電泳測(cè)定枇杷葉中 熊果酸和齊墩果酸的含量。主要條件：未涂層彈性 石英毛細(xì)管(75pmx60cm，有效長(zhǎng)度50cm)；壓力 進(jìn)樣，壓力：3．0×103 Pa；進(jìn)樣時(shí)間：5s； 分離電 壓：24 kV；柱溫：25。C；檢測(cè)波長(zhǎng)：200 nm；運(yùn)行 緩沖液：30 mmol／L SDS，20mmol／L羥丙基一 一環(huán)糊 精，5％乙腈，40 mmol／L硼砂溶液(pH=9．4)；運(yùn) 行時(shí)間：30rain。

 張鋒等[211采用毛細(xì)管電泳高頻電導(dǎo)法測(cè)定夏 枯草中齊墩果酸和熊果酸的含量。主要條件： 以布洛芬為內(nèi)標(biāo)， 采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳， 高 頻電導(dǎo)檢測(cè)； 未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱55 cmx75#m ID，有效長(zhǎng)度46 cm；1．2 mmol／L三乙胺一 HC1(pH=10．60) ， 一環(huán)糊精(0．08mmol／L) 為運(yùn) 行緩沖液； 分離電壓12．5kV； 重力進(jìn)樣10S (高 度20cm)。

 使用高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定齊墩果酸含量具有 高效、高速、微量、操作簡(jiǎn)單和低耗的優(yōu)點(diǎn)，近年 來(lái)在齊墩果酸分析方面逐漸得到重視。

 5 超臨界流體色譜法

 吳玫涵等I2 采用超臨界流體色譜法測(cè) 定懷牛膝及其制劑中齊墩果酸含量。色譜 條件：622型SFC／GC儀(美國(guó)理氏科學(xué)儀器公 司)；SP 6600型數(shù)據(jù)處理機(jī)； 色譜柱： 石英 毛細(xì)管交聯(lián)柱(10mx50／．tm，ID) ； 固定相SB— Cyanopropyl一50： 液膜厚度：0．25pm~ 流動(dòng)相：二氧化碳(99．995％ ) ； 柱溫：9O。C； 檢測(cè) 器：FID (325。C) ； 壓力程序：l5．20 MPa保持7 min，然后以0．81 MPa／min升至20．26 MPa，再以1．22 MPa／min升至35．45 MPa。分流進(jìn)樣0．2／IL， 分流 比100：l； 補(bǔ)充氣： 氮?dú)�。樣品測(cè)定：精密稱(chēng)取懷 牛膝粉(20目，80。C F燥恒重)0．1g，加入2mol／L鹽 酸20mL，超聲振蕩15min， 加熱回流2 h，冷卻后過(guò) 濾，棄去濾液。濾渣用蒸餾水洗至中性，烘干，加 氯仿20mL振搖，水浴回流1 h，趁熱過(guò)濾，用少量氯 仿(2—3 mE)沖洗濾紙， 回收并揮干氯仿，備用。測(cè)定 前精密加入lmL二氯甲烷及l(fā)mL甲羥孕酮內(nèi)標(biāo)液，溶 解后進(jìn)樣測(cè)定。

 氣相色譜測(cè)定齊墩果酸含量需要先衍生處理， 高效液相色譜不能和FID這種靈敏的檢測(cè)器聯(lián)用，超 臨界流體色譜測(cè)定齊墩果酸含量克服了這些缺點(diǎn)， 具有方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。但超臨界流體色譜并 不普及， 目前應(yīng)用較少。

 6 討論

 測(cè)定齊墩果酸含量的方法還有很多，例如：羅 海燕等l2 采用薄層掃描法測(cè)定亮舒片中齊墩果酸 含量， 肖巧清等124]采用旋光法測(cè)定齊墩果酸片的含 量，但由于這些方法定量準(zhǔn)確度不高等特點(diǎn)，現(xiàn)在 使用較少。

 上述各種分析方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，可根 據(jù)不同情況選擇不同方法，但最為常用的是氣相 色譜法和液相色譜法。一般而言，GC的檢出限 L~,HPLC要高， 但齊墩果酸等物質(zhì)熔沸點(diǎn)較高， 難揮發(fā)， 使用GC測(cè)定需要衍牛。HPLC有著分離 效能高、分析速度快及精準(zhǔn)等特點(diǎn)，可對(duì)齊墩果酸等五環(huán)三萜類(lèi)化合物的含量進(jìn)行有效的分析測(cè) 定。HPLC~0定常用色譜條件為：反相Cl8柱，紫外 檢測(cè)器，流動(dòng)相以乙腈：水：磷酸=85：15：0．1％為主體， 可適當(dāng)加入甲醇， 乙酸胺等物質(zhì)，流速1mL／min，檢 測(cè)波長(zhǎng)210nm左右。