芹菜素誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制研究 | 芹菜素誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡作用及機(jī)制研究 |
| 發(fā)布時(shí)間:2013-12-11 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):1476 |
摘 要:目的：研究芹菜素（apigenin，API）致人胃癌細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制。方法：培養(yǎng)人胃癌BGC823細(xì)胞株，加入不同濃度的API，孵育48h。PI染色流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分析測(cè)定凋亡率；羅丹明染色FCM分析測(cè)定細(xì)胞線粒體跨膜電位（△φm）；Caspase-9分光光度法檢測(cè)試劑盒測(cè)定caspase-9活性；Western印跡檢測(cè)線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括bax，bcl-2，caspase-9和caspase-3。結(jié)果：API（20，40和80μg/mL）作用48h能呈濃度依賴性地誘導(dǎo)BGC823細(xì)胞凋亡。而且，API也能降低BGC823細(xì)胞的aCm，增加caspase-9活性，促進(jìn)細(xì)胞色素c（Cytc）釋放，上調(diào)bax。caspase-9和caspase-3蛋白的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴性。結(jié)論：API通過活化線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡。 關(guān)鍵詞:胃腫瘤 芹菜素 凋亡 線粒體跨膜電位 caspase Study on pro-apoptotic effect of apigenin on human gastric cancer cells and its underlying mechanisms Abstract:Objective To determine the effect of apigenin （API） on induction of apoptotic death in human gastric cancer cells and its underlying mechanisms. Methods Human gastric cancer BGC823 cells line was cultured and treated with different concentrations of API for 48 h. Cell apoptosis and mitochondrial membrane potential was determined by flow cytometery （FCM） labeled with propidium iodide （PI） and Rhodamine123, respectively. Caspase-9 activity was determined by caspase-9 colorimetric assay kit. Western blot was used to analyze the expressions of apoptosis mitochondrial signal transduction pathway related proteins including bax, bcl-2, caspase-9 and caspase-3. Results Treatment with API （20, 40 and 80 μg/mL） for 48 h could concentration-dependently induce the apoptotic death of BGC823 cells. Moreover, API could also decrease the cellular △φm, increase the activity of caspase-9 and enhance the releasing of cytochrome c. The protein expressions of bax, caspase-9 and caspase-3 were upregulated by treatment with API, associated with a downregulation of the protein expression of bcl-2. Conclusion API can induce the apoptosis of human gastric cancer cells via activating mitochondrial signal transdution pathway. Key words:gastric cancer; apigenin ; apoptosis ; mitochondrial membrane potential ; caspase 芹菜素(5，7，4’．三羥基黃酮；apigenin， API)是一種分布廣泛的黃酮類化合物，API在 體外能夠顯著抑制白血病、結(jié)腸癌、乳腺癌、黑 色素瘤以及前列腺癌等腫瘤細(xì)胞的增殖作用。 其作用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：(1)誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡：API通過提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，降 低線粒體跨膜電位促使細(xì)胞色素C釋放并激活 capase．9的作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)caspase一3蛋白 酶活化，引起細(xì)胞凋亡¨刮；(2)細(xì)胞周期阻滯： API通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1)的表 達(dá)及降低cyclin 131結(jié)合的周期蛋白依賴激酶 CDK1活性將結(jié)腸癌、乳腺癌、黑色素瘤細(xì)胞阻 滯在G：／M期 J。然而在人前列腺癌LNCaP細(xì) 胞經(jīng)API作用后細(xì)胞周期被阻滯在G。／G．期， 這是由于API可下調(diào)細(xì)胞cyclin D1，D2和cyclin E以及通過p53途徑上調(diào)CDK 抑制因子 p2 1 WAF1和p27 KIP1表達(dá)，從而抑制了CDK2， CDK4，CDK6活性 ；(3)促進(jìn)癌細(xì)胞分化：API 可促進(jìn)HL260細(xì)胞向單核細(xì)胞分化。 細(xì)胞凋亡的調(diào)控根據(jù)其起始信號(hào)的細(xì)胞部 位不同，主要有2條誘導(dǎo)途徑：死亡受體途徑和 線粒體途徑，不同的死亡信號(hào)通過不同的途徑 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。最近的研究表明線粒體是細(xì)胞 內(nèi)死亡信號(hào)的重要感受器與放大器，在細(xì)胞凋 亡早期，核染色體DNA還未改變之前，已出現(xiàn) 結(jié)構(gòu)和功能的變化，說明線粒體在細(xì)胞凋亡調(diào) 控過程中起重要作用 。有研究表明API經(jīng)線 粒體途徑誘導(dǎo)急性髓性白血病細(xì)胞凋亡¨ 。本 研究旨在驗(yàn)證API是否通過活化線粒體信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)通路誘導(dǎo)人胃癌BGC823細(xì)胞凋亡。 1 材料與方法 1．1 主要試劑 Apigenin購自Sigma公司， RPMI．1640培養(yǎng)液購自Gibco公司，新生牛血清 購自杭州四季青生物工程公司，羅丹明1 23， caspase．9分光光度法檢測(cè)試劑盒購自南京凱基 生物公司，caspase．9抑制劑(Ac．LEHD．CHO)購 自Alexis公司，bcl一2，bax，cyt c，caspase一9， caspase一3和13一actin抗體購自Santa Cruz公司，辣 根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗均購 自武漢博士德公司。 1．2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株BGC823由 中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所引進(jìn)。用含有 10％小牛血清、1O0 U／mL青霉素和1O0 Ixg／mL 鏈霉素的RPMI．1 640培養(yǎng)液，在37℃ ，含5％ CO 的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。 1．3 PI染色流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 收集PBS，API(20，40，80 Ixg／mL)作用48 h后 的細(xì)胞2．0×1 0。個(gè)，用4℃ 預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)為 0．75的乙醇固定細(xì)胞，加入碘化丙啶(PI)均勻 染色，30 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。 1．4 細(xì)胞線粒體跨膜電位(A,m)檢測(cè) 收 集PBS，API(20，40，80 Ixg／mL)和API 40 g／mL 加Ac．LEHD．CHO作用48 h后細(xì)胞2．0×10。 個(gè)，用PBS洗滌細(xì)胞2次，重懸于羅丹明1 23染 色液(終濃度5 t~g／rnL)中，于37℃避光孵育30 min，再用PBS洗滌細(xì)胞2次，利用流式細(xì)胞儀 以羅丹明1 23為熒光指示劑檢測(cè)細(xì)胞線粒體 △ m 的改變。羅丹明1 23 的激發(fā)波長(zhǎng)為 475 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。 1．5 Caspase一9活性測(cè)定 取未處理和經(jīng)藥 物處理48 h的細(xì)胞3×1 0�！�5×1 0。個(gè)，按 caspase．9分光光度法檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操 作，即用50 L冰冷Lysis Buffer懸浮細(xì)胞，置冰 上20 min；4℃ 離心(1 0 000 r／min)3 min，把離 心上清轉(zhuǎn)移至新的管中，置冰上；用BCA蛋白定 量試劑盒測(cè)定蛋白濃度；吸取50 L含50～ 200 g蛋白的細(xì)胞裂解上清；如體積不足50 IxL 用Lysis Buffer補(bǔ)足至總體積50 IxL；加入50 L 的2×Reaction Buffer(使用前每50 L 2×Reac— tion Buffer加入0．5 IxL DTl")；加入5 IxL caspase一 9底物并于37℃ 避光孵育4 h；用酶標(biāo)儀在 )L=405 nm測(cè)定其吸光值。通過計(jì)算OD誘 ／ OD剛 a的倍數(shù)來確定凋亡誘導(dǎo)劑組caspase一9 的活化程度。以Lysis Buffer和Reaetion Butier混 合物作為參比。 1，6 Western印跡分析 收集I X 1 0。以上細(xì) 胞，2 500 r／min離心10 min，冰PBS洗2次，加 入1 00 IxL細(xì)胞裂解液(1 0 retool／L Tris．C1 pH 8，0，1 retool／L EDTA ，20％ SDS，5 mmol／L DTr 和10 retool／L PMSF)于冰上裂解1 h， 12 000 r／rain離心5 min，收集上清。Lowry法測(cè)定蛋白含量。加入2O L的5×上樣緩沖液 (250 mmol／L Tris-HCI pH6．8，10％ SDS，50％ 甘油，0．5％ 溴酚藍(lán)，5％ 二巰基乙醇)，加熱變 性。用1 0％ SDS．聚丙烯酰胺凝膠(檢測(cè)Cyt C 時(shí)用1 5％ )電泳分離蛋白質(zhì)。凝膠上的蛋白帶 轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉液封閉膜上的蛋白結(jié)合 位點(diǎn)2 h。加入一抗(bcl-2，bax，caspase-9， caspase．3，Cyt C，1：200；B．a(chǎn)ctin，1：400)，4℃ 孵育 過夜；加相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 (1：2 000)，37℃孵育1 h。ECL檢測(cè)，掃描。 收集細(xì)胞(1×10 ／mL)，于冰浴預(yù)冷的勻漿 緩沖液(250 mmol／L Sucrose，20 mmol／L Hepes／ KOH ，pH7．5，1 0 mmol／L KCI，1．5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，1 mmol／L DTI’，0．1 mmol／L PMSF)"400 L重懸，移入玻璃勻漿器內(nèi) 于冰浴中勻漿5 min，勻漿液于4℃ ，3 000 r／min 離心1 0 rain，共2次，取上清于4℃ ，12 000 r／min 離心1 5 min，收集的上清即為不含細(xì)胞核和線 粒體的胞漿成分。測(cè)定蛋白含量后進(jìn)行Western 印跡分析。 1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。所有 數(shù)據(jù)用元±s表示，采用SPSS1 0．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì) 數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one—way ANOVA)， P<0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié) 果 2．1 API促進(jìn)BGC823細(xì)胞凋亡作用 PI染色 FCM分析結(jié)果顯示，API(20，4O，80 g／mL)處理 BGC823細(xì)胞48 h后的凋亡率分別為1 3．1％ ， 20．6％ ，34．0％ ，較對(duì)照組2．9％ 高。說明API具 有促進(jìn)BGC823細(xì)胞凋亡作用，呈濃度依賴性(圖 1，封二)。 2．2 API對(duì)BGC823細(xì)胞線粒體跨膜電位的 影響 用羅丹明123作為熒光探針測(cè)定線粒 體跨膜電位，其被線粒體攝取的量與△ m成正 比。API(2O，4O，80 g／mL)處理后，BGC823 細(xì)胞的羅丹明123的熒光強(qiáng)度分別為105．0± 3．3，98．4±3．3，65．7±5．0，較對(duì)照組 (138．0±3．5)明顯降低(圖2，封二)，且隨著 API濃度增加熒光強(qiáng)度降低。表明API降低 BGC823細(xì)胞線粒體跨膜電位，與劑量呈正相關(guān)。而API 40 g／mL+Ac-LEHD．CHO組羅丹 明1 23的熒光強(qiáng)度(1 1 5．2±1 1．0)僅稍低于對(duì) 照組，說明Ac．LEHD．CHO 能抑制API降低 BGC823細(xì)胞線粒體跨膜電位的作用。 2．3 API對(duì)BGC823 細(xì)胞caspase-9 活性的 影響 Caspase．9是線粒體誘導(dǎo)凋亡途徑中的 關(guān)鍵caspase，API(2O，4O，80 g／mL)作用于 BGC823細(xì)胞48 h后，分光光度法檢測(cè)caspase-9 活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)caspase-9活性分別為對(duì)照組的 5．0，7．0和8．5倍，而API 40 g／mL合用 caspase．9抑制劑組的caspase．9活性僅比對(duì)照組 增加1．4倍(圖3)。可見API以劑量依賴方式 增加caspase．9活性，caspase-9抑制劑能顯著抑 制API增強(qiáng)caspase．9活性作用。說明API誘導(dǎo) BGC823細(xì)胞凋亡與活化線粒體途徑相關(guān)。 2．4 API對(duì)凋亡線粒體途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影 響 為進(jìn)一步證實(shí)API通過活化線粒體途徑 誘導(dǎo)BGC823凋亡，本研究進(jìn)一步檢測(cè)凋亡線 粒體途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)(圖4)。結(jié)果提示， 隨著API濃度增大，bax蛋白表達(dá)增加，bcl-2蛋 白表達(dá)降低，bax／bc1．2比值逐漸增大，Cyt C釋 放隨API濃度升高而增加，caspase．9和caspase- 3蛋白表達(dá)也隨API濃度升高而增加。Caspase一 9抑制劑Ac．LEHD．CHO 能阻斷API的上述 作用。
圖3 芹菜素(API)對(duì)BGC823細(xì)胞caspase-9活性的影響。 不同濃度的API(20，40，80 g／mL)處理BGC823細(xì)胞 48 h后檢測(cè)caspase-9活性(x±s，，z=3) 與對(duì)照組比 較，}}P<0．01 Fig．3 Effect of API on activity of caspase-9 in BGC823 cells． BGC823 cells were treated with diferent concentrations (20，40，80 g／mL)of API for 48 h，and then activity of caspase一9 was determined(x±5，，z=3) Compared with contro1． } } P <0．01
圖4 芹菜素(API)對(duì)BGC823細(xì)胞線粒體信號(hào)途徑相關(guān)蛋白的影響。不同濃度的API(20，40，80 g／mL)處理BGC823細(xì)胞 48 h，Western印跡分別檢測(cè)bax，bcl一2，細(xì)胞色素C，caspase一3和‘’aspase-9的表達(dá) Fig．4 Effect of API on the expression of mitochondrial signal pathway related proteins in apoptosis in BGC823．BGC823 cells were treated with diferent concentrations(20，40，80 p~g,／mL)of API for 48 h，and then protein expressions of bax，bcl-2，cyto· chrome c。caspase一3 and caspase-9 were determined by Western blot 3 討 論 API可以使人前列腺癌細(xì)胞及人白血病細(xì) 胞HL一60發(fā)生選擇性周期阻滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋 亡。其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能是通過細(xì)胞色素C 的釋放及半胱氨酸酶(casepase一9，casepase一3)的 激活而實(shí)現(xiàn) 。此外，API也可以通過激活 P53／wafl途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。API能使腫瘤 細(xì)胞內(nèi)P53蛋白、P2 1／WAF1蛋白水平升高， 二者可以使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，并通過P53途 徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡 。核因子一KB(NF—KB)、 B細(xì)胞淋巴瘤／ 白血病2(bcl一2)，bax(bcl一2的 家族成員)也參與了API的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡 作用 。NF—KB的活化能阻止處于半胱氨酸 酶聯(lián)反應(yīng)上游的casepase一8活化，并引起凋亡抑 制劑蛋白的表達(dá)。API能夠抑制NF—KB蛋白的 表達(dá)，使bax，bcl一2的比值發(fā)生轉(zhuǎn)變，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本文采用PI染色FCM分析 發(fā)現(xiàn)：隨著API濃度升高，BGC823細(xì)胞凋亡率 增加。說明API具有促進(jìn)BGC823細(xì)胞凋亡 作用。 線粒體跨膜電位在維持線粒體膜的完整性 和功能方面起著重要作用 J。本研究用一種能 被線粒體選擇性吸收的熒光染料羅丹明123作 為指示劑，它的吸收率與△ll，m 成正比，F(xiàn)CM分 析測(cè)定結(jié)果顯示，API能降低BGC823細(xì)胞中羅 丹明l23的熒光強(qiáng)度，呈劑量依賴性。表明API 能以劑量依賴方式降低BGC823細(xì)胞中zX,m。 線粒體依賴性細(xì)胞凋亡通路中，線粒體跨膜電 位降低導(dǎo)致Cyt c釋放增加。本研究用Western 印跡檢測(cè)BGC823細(xì)胞胞漿中細(xì)胞色素c蛋白 的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)隨著API濃度增大，細(xì)胞色素 c表達(dá)增加。以上結(jié)果表明，API能降低 BGC823細(xì)胞線粒體跨膜電位，促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放。 細(xì)胞色素c從線粒體釋放后與ATP、凋亡蛋 白酶激活因子(apoptotic protease activating factor· 1，Apaf．1)聯(lián)合作用，依次激活caspase·9， caspase．3和PARP等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)用 caspase．9分光光度法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)caspase·9 的活性，發(fā)現(xiàn)API能增加BGC823細(xì)胞中 caspase．9的活性。用Western印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)API 能上調(diào)caspase．9和caspase．3蛋白的表達(dá)。Bcl· 2家族成員在細(xì)胞凋亡的線粒體途徑中起重要 調(diào)控作用 。在細(xì)胞凋亡過程中，bc1．2家族 促凋亡成員如bax過表達(dá)，形成同源二聚體后被 激活，發(fā)生構(gòu)象改變，可引起線粒體大量釋放 Cyt c；而抗凋亡成員如bc1．2和bc1．XL過表達(dá)， 與bax形成異源二聚體，可對(duì)Apaf．1結(jié)構(gòu)進(jìn)行 調(diào)控，抑制Cyt c釋放，最終發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡 作用¨ “』。本文用Western印跡檢測(cè)BGC823細(xì) 胞中bax和bc1．2蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)API以 劑量依賴方式上調(diào)bax的表達(dá)，下調(diào)bc1．2的表 達(dá)，使bax／bc1．2的比值增大。而caspase．9抑制 劑Ac．LEHD．CHO能阻斷API的上述作用。說 明API通過調(diào)節(jié)bax／bc1．2比值激活BGC823細(xì) 胞中caspase．9，caspase．3級(jí)聯(lián)反應(yīng)。 綜上所述，API能上調(diào)bc1．2家族促凋亡成 員bax蛋白表達(dá)，下調(diào)bc1．2蛋白表達(dá)，使bax／ bc1．2比值升高，降低線粒體跨膜電位，促進(jìn)Cyt c釋放，從而激活caspase．9，caspase．3級(jí)聯(lián)反應(yīng)， 通過調(diào)控線粒體凋亡誘導(dǎo)途徑誘導(dǎo)人胃癌 BGC823細(xì)胞凋亡。 |
