芹菜素對大鼠生精細(xì)胞凋亡作用的影響 | 芹菜素對大鼠生精細(xì)胞凋亡作用的影響 |
| 發(fā)布時(shí)間:2013-12-11 信息來源:admin 發(fā)布人:admin 點(diǎn)擊次數(shù):1574 |
摘 要:目的研究芹菜素對大鼠生精細(xì)胞凋亡的影響。方法應(yīng)用percoll不連續(xù)密度梯度分離培養(yǎng)大鼠睪丸生精細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察芹菜素對生精細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果芹菜素作用于大鼠生精細(xì)胞，F(xiàn)CM分析顯示芹菜素能促進(jìn)生精細(xì)胞凋亡，并呈劑量依賴方式。結(jié)論芹菜素能呈劑量依賴式促進(jìn)睪丸生精細(xì)胞凋亡。 關(guān)鍵詞:芹菜素 生精細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) 凋亡 The Research on the Apoptosis Effects of Apigenin on the Spermatogenic Cells of Rats Abstract:Objective To investigate the apoptosis effects of apigenin （ certain phytoestrogens） on the spermatogenic cells of rats. Methods Using the technique of Percoll discontinuous density gradients centrifugation, the higher purity of spermatogenic cells were primary cultured. The different concentrations of apigenin were used on spermatogenic cells to observe the apoptosis of sperematogenic cells by using the technigue of flowcytometry. Results It was indicated that apigenin promoted the apoptosis rate of spermatogenic cells in dose-dependence. Conclusions Apigenin could inhibit the reproduction of spermatogenic cells and promoted their apoptosis. Key words:apigenin; spermatogenic cells; cells culture; apoptosis 芹菜素對作為一種黃酮類化合物，有鎮(zhèn)靜、安 神、抑制腫瘤物質(zhì)、降壓、抗氧化、抗菌等多種生 物學(xué)作用。有研究表明芹菜素對前列腺癌CA— HPV一10細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，而對NHPE 和PZ—HPV一7細(xì)胞則無誘導(dǎo)凋亡的作用 J。這 說明芹菜素抑制腫瘤作用不但通過直接抑制細(xì)胞生 長而且還通過選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來發(fā)揮作 用。但在芹菜素影響腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的同時(shí)， 是否對正常細(xì)胞也有作用，此方面的研究較少。本 研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)大鼠生精細(xì)胞的方法觀察芹菜素對生精細(xì)胞的作用，以探討芹菜素對雄性大鼠生殖系統(tǒng)的作用。 1 材料與方法 1．1 材料 1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康Sprague—Dawley雄性 大鼠，體重250～300g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中 心提供。 1．1．2 實(shí)驗(yàn)試劑 高糖DMEM (Sigma公司)，1：250胰蛋白酶(Sigma公司)，芹菜素(陜西慧 科)，percol1分離液(Phamacia公司)，AV—PI雙 染凋亡試劑盒。 1．2 方法 1．2．1 Percoll不連續(xù)密度梯度離心液的制備 將無菌的純Percoll液用PBS液稀釋，分別配 成22％、30％ 、40％、50％、60％ 的濃度液體待 用 J。將上述濃度的離心液按60％、50％、40％ 、 30％ 、22％濃度順序各2ml加入到lOml圓底離心 管中，形成一個(gè)五層不連續(xù)密度梯度的離心液備 用。 1．2．2 生精細(xì)胞的制備 大鼠清醒狀態(tài)下斷頸處死后，于無菌條件下取 出睪丸，立即用含100 IU／ml青霉素的Hank’S液沖 洗3次，沖凈血污后，浸入冰的DMEM培養(yǎng)液中 (含250 IU／ml青霉素，0．5mg／ml鏈霉素， lOmmoL／L Hepes，pH7．4，10％小牛血清)去除被 膜，將睪丸組織剪成(1～2)mm 小塊，放人 DMEM培養(yǎng)液中，靜置5min，吸去DMEM培養(yǎng)液，放人0．25％的胰蛋白酶消化液中(體積為組織的 30～50倍)，搖勻后放人37℃的水浴箱中消化，并 不時(shí)震蕩15min，小牛血清中止消化，取懸液，將 未消化完全的組織重復(fù)上面過程再消化1次，將幾 次消化后的細(xì)胞懸液用100 目的銅網(wǎng)過濾， 1000rmp離心5min；棄上清，用2ml的DMEM重 新懸起。 1．2．3 生精細(xì)胞的不連續(xù)密度梯度離心法分離提 純 粗制的細(xì)胞懸液加到預(yù)制的Percoll密度梯度 離心液上，1500rmp離心25min，于第二層(30％ 濃度)得到提純的生精細(xì)胞，可用長的帶有斜口的 針頭的注射器輕輕吸取，吸取細(xì)胞的過程中，切勿 混雜其它分離層的液體。 1．2．4 細(xì)胞計(jì)數(shù) 取0．1ml 0．4％臺(tái)盼藍(lán)和0．9ml 細(xì)胞懸液，立即置顯微鏡下計(jì)數(shù)，分別檢測細(xì)胞存 活率。 1．2．5 生精細(xì)胞的體外培養(yǎng) 將提純的細(xì)胞加人培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液中， 制成密度為3×10 ／ml的細(xì)胞懸液，接種在無菌的 6孔培養(yǎng)板內(nèi)(預(yù)敷多聚賴氨酸)，每孔5ml，放人 CO 孵箱內(nèi)孵化。每24h在倒置顯微鏡下觀察各孔 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，然后更換新的培養(yǎng)液。 1．2．6 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡狀況 細(xì)胞以3×10 ／ml密度接種于六孔培養(yǎng)板內(nèi)， 細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸出板內(nèi)液體，換成含不同濃度 芹菜素的培養(yǎng)液。 一組：生精細(xì)胞組(空白對照組)；二組：生 精細(xì)胞+芹菜素(10 M)；三組：生精細(xì)胞+芹 菜素(10 M)；四組：生精細(xì)胞+芹菜素(10 M)；五組：生精細(xì)胞+芹菜素(10 M)。 每組設(shè)4個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，吸出孔 內(nèi)液體，加人0．25％ 的胰蛋白酶，消化3～5min 后，小牛血清中止消化，收集細(xì)胞懸液，lO00rmp 離心5min，棄上清，用PBS (pH7．2)懸起， 1000g離心5min，棄上清，PBS (pH7．2)懸起， 細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)達(dá)到(1～5) ×10。個(gè)，離心 1000rmp，5min，棄上清，將細(xì)胞重懸于2001xl的 Binding Buffer中，加人101xl Annexin V—FITC和 5 l PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15min。加人 3001xl的Binding Bufer，在1h內(nèi)上機(jī)檢測。 1．2．7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差( ±s) 表示，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用單因素方差分析及q 檢驗(yàn)。 2 結(jié) 果 實(shí)驗(yàn)中每份樣本檢測1×10 個(gè)l~2_k細(xì)胞，由 計(jì)算機(jī)測量細(xì)胞凋亡率，如表1。 表1 芹菜素對大鼠生精細(xì)胞凋亡的影響(工± )
注：Api為芹菜素，與空白組比較。P<0．05 二組與三組比較，三組與四組比較，均有顯著 性差異(P<0．05)，結(jié)果顯示生精細(xì)胞的凋亡率 在芹菜素濃度為10一～10 M 問呈劑量依賴性。 空白組生精細(xì)胞的凋亡率明顯低于給藥組，有顯著 性差異(P<0．05)。10 M組細(xì)胞凋亡率與10 M組無顯著性差異，但是死亡率高于其它各組。 這說明芹菜素對大鼠生精細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用并呈 劑量依賴性，高濃度芹菜素對細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作 用。 不同濃度芹菜素對生精細(xì)胞凋亡作用的AV— PI雙染流式結(jié)果見圖1。 3 討 論 有研究表明，芹菜素通過提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水 平，改變線粒體跨膜電位促使細(xì)胞色素C釋放到 胞漿并激活Capase一9的作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi) Caspase一3蛋白酶活化，引起細(xì)胞凋亡 。有文獻(xiàn) 表明，芹菜素通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白Bl(eyelin B1)的表達(dá)及降低eyelinB1結(jié)合的周期蛋白細(xì)胞 依賴激酶CDK1活性將癌細(xì)胞阻滯在G2M期 。 芹菜素誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制還可能是通過激活P53／wafl 途徑發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用。芹菜素能使腫瘤細(xì)胞內(nèi) P53蛋白、P21／wafl蛋白水平升高，二者可以使細(xì) 胞周期發(fā)生阻滯，并通過P53途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋 亡 。此外，核因子一kB (NF—kB)、B淋巴細(xì) 胞瘤／白血病(Bel一2)、Bax(Bel一2的家族成 員)也參與了芹菜素的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用。 NF—kB的活化能阻止處于切冬酶級聯(lián)反應(yīng)頂端的 Capase一8活化，并引起凋亡抑制劑蛋白(IAP)的表 達(dá)，使Bax、Bel一2的比值發(fā)生轉(zhuǎn)變，最終誘導(dǎo)凋亡 的發(fā)生 J。本實(shí)驗(yàn)中采用流式細(xì)胞儀結(jié)合Annexin V FITC／P I檢測生精細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)生精細(xì)胞 的凋亡率隨著芹菜素濃度的增高而增高。芹菜素對體外培養(yǎng)的生精細(xì)胞有促進(jìn)其凋亡作用，并在芹菜素濃度10～～l0-SM濃度問成劑量依賴性。 |
